总RNA提取试剂盒

概述^[1]

随着转录组学、蛋白组学、代谢组学等组学的不断涌现，生物学研究已经跨入后基因组时代。转录组学作为一个率先发展起来的技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。转录组学(transcriptomics)，是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。从生物材料中获得高质量的RNA不仅是转录组学研究的前提，也是后续RT-PCR、Northern杂交、cDNA文库构建等分子生物学研究的基础。

目前，提取总RNA的方法有Trizol提取法、苯酚法、异硫氰酸胍法和CTAB法。但是由于RNA酶的广泛存在和难以灭活的顽固本性，使得RNA的抽提纯化和后续工作特别困难。虽然Trizol试剂和各类RNA抽提纯化试剂盒的广泛应用使得RNA抽提和纯化不再特别困难，但是这些提取方法普遍存在提取耗时、提取纯度不高、提取产量低或提取失败等各种问题。

到目前为止，涉及RNA提取的工作仍然是分子生物学研究中最难以克服的难题。其中，植物材料总RNA的提取更是一个有待解决的分子生物学上的难题。这是因为植物材料尤其是植物的果实中存在大量的多酚和多糖化合物，它们和植物中的RNA结合形成一种复合物，从而严重影响到RNA的提取质量和产量。曾有报道指出有些RNA的提取方法可运用于富含多酚和多糖的材料，包括使用PVP和乙醇沉淀，盐酸胍，异丙醇等。但是，用这些方法在提取植物果实的RNA时，仍不能得到满意的结果。因此迫切需要一种简便、高效、经济且通用性较好的适用于总RNA的提取方法。

通过多次实验，最终研制出酚-异硫氰酸胍结合硅基质柱的方法的总RNA提取试剂盒及方法，使用本试剂盒及方法不仅成功地从植物各种组织包括果实中提取到了高质量的总RNA，而且还可以从抗凝全血等多种材料中提取高纯度高质量的总RNA。提取的总RNA经过检测显示，完整性和纯度可以满足进一步RT-PCR的实验要求以及相关的下游分子生物学实验要求。

应用^[2]

总RNA纯化试剂盒提供了一种从培养的动物细胞，组织样品，血液，血浆，血清，细菌，酵母，真菌，植物和病毒中分离和纯化总RNA的快速方法。该试剂盒可纯化所有大小的RNA，从大mRNA和核糖体RNA到小RNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA）。优先从其他细胞成分（如蛋白质）中纯化RNA，而无需使用苯酚或氯仿。纯化的RNA具有最高的完整性，可用于许多下游应用中，包括实时PCR，逆转录PCR，Northern印迹，RNase保护和引物延伸以及表达阵列分析。

Norgen的纯化技术Purification基于旋转柱色谱法，使用Norgen的专有树脂作为分离基质。优先从其他细胞成分（例如蛋白质）中纯化RNA，而无需使用苯酚或氯仿。该过程包括首先使用提供的BufferRL裂解目的细胞或组织。然后将乙醇加入到裂解物中，并将溶液加载到旋转柱上。树脂结合RNA的方式取决于离子浓度。因此，只有RNA会结合到色谱柱上，而污染的蛋白质将在流出物中被去除或保留在树脂的顶部。然后用提供的洗涤液A洗涤结合的RNA，以去除任何残留的杂质，并用洗脱液A洗脱纯化的总RNA。纯化的RNA具有最高的完整性，可用于多种下游应用。

操作步骤^[3]

1.样品处理：a.植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。

b.动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。

c.贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml裂解液。用取样器吹打混匀。

d.细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。

e.血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1ml裂解液混匀。

2.将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3.向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。

4.2-8℃12000rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。

5.吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12，000rpm离心2min，弃废液。

6.第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃12000rpm离心2min，弃废液。

7.向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃12，000rpm离心2min，弃废液。

8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃12，000rpm离心2min，弃废液。

9.12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。

10.将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ulRNasefreeddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到RNA。

注意事项

1，所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。

2，RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯，需电泳检测。

主要参考资料

[1] CN201610220261.3一种通用型总RNA提取试剂盒及方法

[2] Total RNA Purification Kit

[3] 总RNA提取试剂盒操作说明