病毒RNA快速提取试剂盒的使用

概述^[1-2]

试剂盒是一种将测定一种成分所需要的2种或2种以上的试剂及实验室一般用品连同操作说明书包装在一起，形成商品化的试剂单位，即由厂家提供给用户使用的一种套装试剂，使用者除用自备的蒸馏水或试剂盒提供的缓冲液进行复溶试剂的操作外不需要作任何试剂配制。目前检测试剂已广泛采用这一方式提供，kit的应用不但节约人力减少配制误差，而且有利于试剂质量的保证和实验室间方法学的统一，提高了可比性。

病毒RNA快速提取试剂盒采用特异性结合病毒RNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，病毒RNA提取试剂盒适合于从无细胞体液，包括血浆、血清、腹水、培养细胞上清液、脑脊髓液及尿液等中快速提取高纯的病毒RNA。该产品可以满足绝大多数的病毒RNA的提取要求，如病毒RNA：HCV（丙肝病毒），HIV（艾滋病毒），和HTLV（人类嗜T淋巴细胞病毒）；等等。病毒裂解后，RNA后在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的病毒RNA从硅基质膜上洗脱。纯化后的病毒核酸无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR/RT-PCR等分析。

产品特点^[2]

1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。

3.多次柱漂洗确保高纯度，提取的病毒RNA纯度高，质量稳定可靠，可适用于各种常规操作，包括PCR/RT-PCR等。

操作步骤^[2]

次使用前请先在10ml漂洗液RW中加入40ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。

1.200μl血清等体液（需回复到室温，不足可用0.9%NaCl或者PBS补足）转入上述1.5ml离心管，加入400μl裂解液RLB，立刻涡旋振荡充分混匀。

2.室温(15-25℃)放置10分钟，每隔5分钟，振荡混匀一次。

3.加入450μl无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。如果周围环境高于25℃，乙醇需要冰上预冷后再加入。

4.将上述混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13，000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。如果总体积超过750μl，可分两次将溶液加入同一个吸附柱RA中。

5.加500μl去蛋白液RE，12，000rpm离心30秒，弃废液。

6.加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12，000rpm离心30秒，弃废液，加入500μl漂洗液RW，重复一遍。

7.将吸附柱RA放回空收集管中，13，000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

8.取出吸附柱RA，放入一个RNasefree的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μlRNasefreeH20（事先在65－70℃水浴中加热效果更好），室温放置1分钟，12，000rpm离心1分钟。如果想得到较多量的RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12，000rpm离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于20μl，体积过小降低洗脱效率，减少RNA产量。

9.RNA病毒建议立刻使用，否则立刻短期放置在-70℃备用。

制备^[3]

病毒RNA快速提取试剂盒包括以下试剂：

1)红细胞裂解液：含有碳酸氢钾10mmol/L‑12mmol/L，氯化铵135mmol/L‑160mmol/L，PH值为8.0的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)0.1mmol/L‑1mmol/L；

2)白细胞裂解液：含有PH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris‑HCl)5‑20mmol/L，PH值为8.0的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)50‑150mmol/L，十二烷基硫酸(SDS)0.5‑2％；

3)消化液：含十二烷基硫酸(SDS)1‑5％；

4)纯化液：含饱和氯化钠溶液6mol/L；或含饱和醋酸钠溶液5.0‑6.0mol/L；

5)DNA保存液：为经过灭菌处理的PH值为8.0‑8.5的Tris‑HCl溶液，或PH值在7.0‑8.5范围内灭菌ddH2O.

主要参考资料

[1] 协和医学词典

[2] 病毒RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

[3] CN201110064203.3人类全血中病毒基因组DNA提取试剂盒及方法