AGL1农杆菌感受态细胞的使用方法

AGL1农杆菌感受态细胞概述^[1]

AGL1菌株为C58, RecA型背景，核基因中含有筛选标签一一 利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb,为了便于转化操作，此菌株携带无自身转运功能的琥珀碱型hi质粒phiBo542Dh—DNA,此质粒含有vir基因(vir基因是h--DNA插入植物基因组必需的元件，phiBo542Dh--DNA质粒自身的h--DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体h--DNA顺利转移)。phiBo542Dh--DNA型hi质粒含有筛选标签: strep, 赋予AGL1菌株链霉素抗性，适用于水稻、拟南芥、杨树等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率可达5X 103cfu/ug。

使用方法^[1]

1.取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。每100ul感受态加1ug(体积不大于10ul)质粒DNA,用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37°C水浴5分钟、冰浴5分钟。

2.加入700ul无抗生素的LB或YEB液体培养基,于28℃振荡培养2~3小时。

3. 6000rpm离心一分钟收菌，留取10ul左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

注意事项^[1]

1.感受态细胞在冰上融化。

2.混入目的DNA时应轻柔操作。

3.当平板只含有50ug/ml kan时，28℃培养48h即可;平板中同时加入50ug/ml kan, 20ug/ml rif时， 需28℃培养60h;如果使用的平板含有50ug/ml rif则需要28℃培养82--90h

主要参考文献

[1] 杨佳 怡荣 张立全 牛一丁 王秀珍 哈斯阿古拉；月见草△6-脂肪酸脱氢酶基因转化油菜的研究；华北农学报