ACHN细胞的细胞培养方法

ACHN细胞概述^[1]

人肾细胞腺癌细胞

• 组织来源： 肾转移灶：胸腔积液
• 细胞种属： 人源
• 生长特性： 贴壁
• 培养基： MEM
• 形态特征： 上皮细胞
• 传代方法： 每周2-3次更换新鲜培养基，1:2至1:3比例传代培养
• 培养条件： 胎牛血清至最终浓度为10％。环境：空气，95％;二氧化碳（CO2），5％；温度，37℃
• 细胞描述： 源自22岁高加索男性，皮下接种至裸鼠体内21天100%发展成肿瘤
• 细胞冻存： 液氮冻存（冻存液基础培养基+20%FBS+10%DMSO）
• 细胞运输： 干冰运输（2ml冻存管）或活细胞运输（T25瓶）

ACHN细胞注意事项^[1]

复苏细胞接收后的处理：

1.收到细胞后，请首先检查培养瓶是否破损或漏液，培养液是否混浊，如有漏液及培养液混浊情况请立即拍照把图片发给我们。

2.75%酒精消毒瓶身后放培养箱中静置4-6h后，在显微镜下确认细胞状态并拍照100倍和200倍的照片，若有贴壁细胞脱落，可收集上清离心，将沉淀用新的培养基接种至新的培养瓶或培养皿中。

3.建议收到当天不要消化处理，如果细胞长满90%，可选择传代处理。

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

主要参考文献

[1] 杨林 吴小候 罗春丽 何云锋 张尧 陈雄 张龙 陈力学；肾癌ACHN细胞exosome对自身细胞增殖和凋亡的影响；《南方医科大学学报》2012年 第10期。