米尔贝肟的制备及含量测定

背景及概述^[1][2]

米尔贝肟(MilbemycinOxime)是大环内酯类抗体内外寄生虫药物，是米尔贝霉素A3和A4的肟衍生物。1997年，我国台湾地区推出台湾诺华股份有限公司生产的以米尔贝肟为主要成分的倍脉心，作为犬猫预防心丝虫与肠内寄生虫内服药，是米尔贝肟首次在中国应用。米尔贝肟具有广谱的抗寄生虫作用，对体内、体外寄生虫特别是线虫和节肢动物有良好的驱杀作用。

制备^[1]

米尔贝肟的制备方法，其步骤如下：1、称取130Kg经干燥的米尔贝菌丝体，米尔贝霉素A3和A4的标定含量分别为0.55％和2.57％，将其加入到1500L搅拌提取罐，加入体积比为6：1的正庚烷、丙酮混合溶剂750L，30rpm搅拌提取2h，过滤，滤饼再按上述条件提取2次，合并滤液。将滤液泵入浓缩釜，55℃减压浓缩至约300L，得到浓缩液A。

2、将上步的浓缩液A转移至1000L萃取釜，加入85％乙醇水溶液300L，25rpm搅拌15min，静置30min，分液，上层正庚烷相用300L85％乙醇溶液再萃取一次，合并萃取液，55℃减压浓缩至150L，得到浓缩液B。

3、将上步的浓缩液B转移至500L萃取釜，用氨水调节pH至9.5，加入体积比为95：5的正庚烷、丙酮混合溶剂150L，30rpm搅拌15min，静置30min，分液，下层水相再萃取一次，合并萃取液，将其转入500L搅拌罐，加入15Kg无水硫酸镁，搅拌10min，过滤，将滤液在55℃下减压浓干得米尔贝霉素浸膏14.9Kg，米尔贝霉素A3、A4标定含量分别为4.03％、20.12％，米尔贝霉素A3和A4的提取收率分别为84.0％和89.7％。

4、将上述米尔贝霉素浸膏用60L二氯甲烷溶解转移至100L反应釜，加入Tempo(四甲基哌啶氮氧化物)52g，三氯化铁1350g，亚硝酸钠578g，35℃搅拌反应2h，取样检测，反应完全后，过滤，滤液在35℃减压浓干得米尔贝酮。

5、将米尔贝酮用300L65％乙醇水溶液溶解，转移至1000L萃取釜，加入体积比为95：5的正庚烷、丙酮溶液300L，搅拌15min，静置60min，分液，下层乙醇溶液再萃取一次，合并正庚烷相，45℃减压浓干，得米尔贝酮纯化品。

6、米尔贝酮纯化品用甲醇、二氧六环溶解，滴加盐酸羟胺溶液，30℃反应16小时，将反应体系浓缩，用二氯甲烷-水体系萃取，二氯甲烷相经干燥、浓缩得米尔贝肟粗品；将米尔贝肟粗品用三氯甲烷和正庚烷混合溶剂结晶，结晶品用乙醇溶解，在搅拌下滴加到水中析晶，过滤、干燥得米尔贝肟成品2.85Kg，总收率为70.3％。

含量测定^[2]

一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定LC-MS/MS方法，血浆样品进行如下处理：1mL血浆样品加入4mL乙腈和0.3g氯化钠，在微型混合器上充分涡旋1min，以3500r/min离心5min，取上清于尖底玻璃离心管中，50℃氮气流下吹干，残留物按1∶9比例加3mL甲醇-5mmol/L乙酸铵，涡旋混匀，于C18固相萃取柱进行纯化；依次用3mL甲醇、3mL水活化萃取小柱，加入上样液，用2mL水冲洗，再用3mL10∶90体积比的甲醇-5mmol/L乙酸铵和3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃氮气流下吹干，残渣用1mL流动相溶解，过0.22μm微孔尼龙膜，取5μL进样，采用液相色谱-质谱联用仪按以下色谱条件进行LC-MS/MS分析：

离子化方式为电喷雾条件，氮气喷雾压力49psi，喷雾电压4800V，氩气压力20psi，温度300℃，SourceCID-12V。米尔贝肟检测的m/z为536。全扫描方式检测m/z为536的碎片离子；流动相组成：乙腈∶0.5mmol/L乙酸铵＝85∶15，流速0.25mL/min，柱温20℃。

所述的生物样品优选为犬血浆。

主要参考资料

[1]CN201510742723.3一种米尔贝肟的制备方法

[2] [中国发明,中国发明授权] CN201010252616.X 一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定LC-MS/MS方法