231细胞的传代与冻存方法

231细胞概述^[1]

231细胞来自患有转移乳腺腺癌的51岁女病人的胸水。 在裸鼠和ALS处理的BALB/c小鼠中，它能形成低分化腺癌（III级）。 细胞表达WNT7B癌基因。

培养条件^[1] 

37℃，100% 空气，无菌恒温培养。231 细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来复苏、 传代、冻存，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便后继研究顺利进行。

细胞传代^[1] 

1. 当细胞融合度达到 90%以上时，给细胞传代；

2. 37°C 水浴预热培养基；

3. 在超净台中，弃培养基，加入 2-5mlPBS 清洗细胞后，再加入 1ml 胰酶消化细胞；

4. 显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入 5ml 培养基终止消化；

5. 用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；

6. 将细胞移入离心管中，1000rpm 离心 5min；

7. 弃上清，加入 5ml 的培养基（含 10% FBS）重悬细胞后转入没有透气孔的 T25 瓶中（确保细胞贴壁后融合度在 25-50%之 间），细胞密度在 1×104 cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25 瓶）， 混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布； 8. 将培养瓶瓶盖拧紧后置于 37°C 的无菌培养箱中培养。

细胞冻存方法^[1] 

1. 37°C 水浴预热培养基；

2. 消化细胞后给细胞计数：

1>. 洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；

2>. 充分混匀细胞，取少量(0.1-0.5ml)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取 20ul 混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；

3>.显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；

4>.细胞密度=细胞总数/4×10000×2； 这里 10000 是不变的，因为计数的细胞是在体积为 1mm×1mm×0.1mm 即 10-4cm3 计数池内，1cm3=1ml，将四个计数区 的细胞数除以 4 取平均数，乘 2 是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。

5>.细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。

注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。

3. 当细胞密度达到传代密度且细胞活性在 90%以上时，可以冻存细胞。

4. 在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm 离心 5min。

5. 弃上清，用 70%培养液+20% FBS+10%DMSO 的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为 1-3×106/ml。

主要参考文献

[1] 林宇，岳丽玲，蒋丽艳；岩大戟内酯B对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。《中国实验方剂学杂志》