GENOMEPLEX单细胞全基因组扩增试剂盒的应用

背景^[1-3]

GENOMEPLEX单细胞全基因组扩增试剂盒是用于从单细胞（或数个细胞）中制备和扩增全基因组的试剂盒。它是整合单细胞裂解液和全基因组扩增试剂盒而成。GENOMEPLEX单细胞全基因组扩增试剂盒利用了Sigma一项专利技术，该技术基于基因组DNA随机片段化的原理，所得的小片段转化为两侧含有通用引物位点的PCR扩增文库分子。WGA通过通用寡核苷酸引物进行的文库分子PCR扩增实现。每个细胞都是独一无二的–它占据了独特的空间位置，它的复制基因组中携带了独特的错误。目前多种新型分析技术，如NGS，都是为细胞群体而设计的，需要一定的样本量。对于一些特殊样本或应用，如CTC或PGS/PGD应用等，它们需要分析单个细胞中的体细胞DNA突变或从胚胎细胞分化至8个细胞时取出一个单细胞，对里面的全基因组进行扩增以便进行胚胎植入前的遗传病诊断或筛查。显而易见的是，单细胞中的DNA（大约只有6 pg DNA）无法满足测序的mg级样品量需求。为了从少量样品中获得更多信息，全基因组扩增技术（WGA）应运而生。

目前的WGA策略主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增（DOP-PCR）、多重置换扩增（MDA），以及置换预扩增和PCR扩增的组合（MALBAC）。这三种WGA策略采用不同的实验操作和不同的酶，表现出不同的性能和偏向，适合不同的应用。本产品有如下优点：

1．可以扩增单个细胞的基因组达上万倍。

2．具有全基因组扩增的所有特点，包括高产量和高保真性。

3．可使用各种来源的样品，包括全血、干血、发根、口腔粘膜刮液、培养细胞、真菌、病毒等。

4．产物可用于多种后续试验，包括多重PCR、长片端PCR、定量PCR、克隆、文库构建、单倍型分析、测序、基因芯片分析、各种遗传分析（片段差异，微卫星差异、SNP、STR）等。

应用^[4][5]

用于单细胞全基因组技术的建立和评价

单细胞是多细胞生物的基本单元,多细胞生物的发育从单细胞开始,在严格的时间和空间序列中不断分裂,但是这样的复杂过程只能在单细胞水平才能真正理解。另外,多细胞生物体内每个细胞都处于独特的微环境中,没有两个完全一样的细胞,特别是肿瘤组织中,高度异质性的存在使得从单细胞的角度进行研究成为必须。结合单细胞分选技术,通过全基因组扩增技术和高通量分析技术,单细胞的全基因组分析已经成为可能,并已有一些应用的实例。目前,单细胞分选技术大多局限于对悬浮细胞的分选。应用于实体瘤研究领域则需要将实体瘤组织消化成细胞悬液,这样一来,分选的细胞就丢失了所在的空间信息,因此,该法对于特定空间位置的细胞分选就无能为力了。

本文所建立的方法不仅对能对单个悬浮细胞进行分选,更重要的是建立了一种组织切片中完整单个细胞核的激光显微切割分选方法。该方法的建立为空间位置特异的细胞分选,例如转移的少量癌细胞的分选提供了方法,并将大大减低测序的费用。单细胞的基因组信息非常少,人的单个细胞基因组DNA量只有6pg,对这么微量的基因组DNA进行测序,首先必须进行全基因组放大。采用了GenomePlex Library的单细胞全基因组放大方法,并对该法的扩增效率、重复性、保真性与扩增线性进行了研究,研究结果说明所得到的全基因组放大产物适用于下游的高通量研究。

参考文献

[1]No evidence of clonal somatic genetic alterations in cancer-associated fibroblasts from human breast and ovarian carcinomas.Qiu W,Hu M,Sridhar A,Opeskin K,Fox S,Shipitsin M,Trivett M,Thompson ER,Ramakrishna M,Gorringe KL et al.Nature Genetics.2008

[2]Frequent down-regulation of major histocompatibility class I antigen expression on individual micrometastatic carcinoma cells.Pantel,K,Schlimok,G,Kutter,D,Schaller,G,Genz,T,Wiebecke,B,Backmann,R,Funke,I,Riethmüller,G.Cancer Research.1991

[3]Total-Genome Analysis of BRCA1/2-Related Invasive Carcinomas of the Breast Identifies Tumor Stroma as Potential Landscaper for Neoplastic Initiation.Weber F,Shen L,Fukino K,et al.The American Journal of Human Genetics.2006

[4]Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification.FB Dean,JR Nelson,TL Giesler,RS Lasken.Genome Research.2001

[5]杨祎. 单细胞全基因组技术的建立和评价[D].上海交通大学,2012.