Imprint Ultra Chromatin Optimization Kit的应用

背景^[1-3]

Imprint Ultra Chromatin Optimization Kit（染色质免疫共沉淀优化试剂盒）是一组完整的优化的试剂，可以用来对哺乳动物细胞或组织进行高通量染色质免疫共沉淀；此高特异性和灵敏度的试剂盒适合用来富集特异性的染色质片断。优化的方案和组分使得非特异性背景降低并提高目的蛋白-DNA复合物的收集量。通过此试剂盒收集的DNA可以用于各种小有实验，如PCR（ChIP-PCR），microarrays（ChIP-on-chip），和sequencing（ChIP-seq）。

蛋白质-DNA相互作用在细胞功能方面起到了重要作用，比如信号传导、基因转录和染色质降解，DNA复制和重组，表观沉默等辨别DNA结合蛋白的靶标以及了解蛋白质-DNA相互作用对于研究细胞各项过程有着重要的作用。染色质免疫共沉淀提供了一个研究蛋白质-DNA相互作用的强有力的工具。它可以通过PCR（ChIP-PCR），microarrays（ChIP-chip），or sequencing（ChIP-seq）检测活细胞内结合在特定序列上的蛋白.比如，通过ChIP-PCR检测特定基因启动子区域不同条件下组蛋白H3-k9甲基化（meH3-K9）的程度.而在基因组范围内启动子区域富集的甲基化H3-K9可以用ChIP-on-chip或是ChIP-sequencing测定.ChIP分析要求参与实验的DNA含有的背景很低，这样才能识别真正的转录因子富集区域.在ChIP实验中的高背景主要是未洗充分导致，或者是交联逆转不够充分，DNA片段长度不适合，或是RNA片段的干扰.为了有效地捕获转录因子-DNA复合物（通常含量很低），就需要高质量的ChIP方案。

特点：1.高效率阳性DNA和阴性对照产物之比大于500，每次反应只需2000个细胞2.优化的缓冲液和方案使得ChIP背景极低，提高了反应的灵敏度和特异性3.抗体效率高，采用了化结合位点数量的融合型抗体4.反应时间短，只需5h 5.灵活便捷，可以进行单个样品实验，也可以高通量实验6.产物可以进行多种下游实验，如ChIP-PCR，ChIP-on-chip，和ChIP-seq。

应用^[4][5]

用于p53及其异构体113p53/133p53的功能机制研究和体外染色体免疫共沉淀技术的构建

p53可被多种胁迫信号激活,决定细胞的生与死,但p53蛋白到底如何精确调控纷繁复杂的下游信号通路,至今仍是一个未被完全解开的谜题。近年来发现p53存在众多异构体,对这些异构体蛋白功能的研究将有助于揭示p53信号途径调控的谜团。113p53(斑马鱼)/133p53(人)是N-端缺失的p53异构体,已有研究证明113p53/133p53具有拮抗p53介导的细胞凋亡功能。

结果如下：

1)采用斑马鱼p53抗体Zfp53-N(只能识别全长p53)进行免疫共沉淀,利用另一个斑马鱼p53抗体Zfp53-A7C10(可识别全长p53和113p53蛋白)检测沉淀蛋白,首次证实了内源性p53与113p53可在DNA损伤条件下互作形成蛋白复合物。进一步构建113p53蛋白寡聚结构域的单氨基酸突变体,找到两个丧失与p53蛋白结合能力的113p53突变体。利用这两个突变蛋白,揭示了113p53与p53的蛋白互作对于113p53拮抗p53介导的细胞凋亡功能是必不可少的。

2)通过在人的细胞系中过表达p53、133p53或两者共同过表达,利用qRT-PCR技术检测代谢相关基因表达,我们发现133p53能够抑制p53对Gls2、TIGAR和Sestrinl的转录激活作用,特别是谷氨酰胺酶Gls2基因,被显著下调一半。实验结果提示133p53可能在抑制有氧代谢、促进糖酵解、促进细胞生长等信号途径中扮演重要角色。

3)发现△113p53蛋白在野生型斑马鱼胚胎中能被γ-射线照射而非紫外线照射或热激诱导大量表达,深入研究表明113p53可以通过直接结合到DNA双链损伤(DSB)修复相关基因如rad51、rad52和ligase4启动子中一些新型的反应元件,来促进它们的转录表达,首次证明了113p53可独立于p53而发挥调控功能。

参考文献

[1]DBD2BS:connecting a DNA-binding protein with its binding sites[J].Ting-Ying Chien,Chih-Kang Lin,Chih-Wei Lin,Yi-Zhong Weng,Chien-Yu Chen,Darby Tien-Hao Chang.Nucleic Acids Research.2012(W1)

[2]Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci[J].Cell.2009(1)

[3]Autophagy in filamentous fungi[J].Judith K.Pollack,Steven D.Harris,Mark R.Marten.Fungal Genetics and Biology.2008(1)

[4]Histone modifications and dynamic regulation of genome accessibility in plants[J].Jennifer Pfluger,Doris Wagner.Current Opinion in Plant Biology.2007(6)

[5]欧兆.p53及其异构体Δ113p53/Δ133p53的功能机制研究和体外染色体免疫共沉淀技术的构建[D].浙江大学,2016.