SEQPLEX DNA扩增试剂盒的应用

背景^[1-3]

SEQPLEX DNA扩增试剂盒用于全基因组扩增（WGA）的SeqPlex增强型DNA扩增试剂盒,专门针对极小量或降解/高度片段化的DNA进行二代测序（NGS）。染色质免疫沉淀（ChIP）或福尔马林固定的石蜡包埋组织样品（FFPE）的DNA含量,通常不能满足成功制备二代测序文库的需求。

第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序，而二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长（不超过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短的特点。

二代测序适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区），而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法（Shotgun method）打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。SeqPlex试剂盒可对这类DNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化DNA样品进行预扩增。该试剂盒是WGA产品线的延伸产品,已被整合到Illumina、SOLiD TM 454测序工作流程中。SEQPLEX DNA扩增试剂盒采用随机引物技术扩增片段化DNA,如ChIP或FFPE有助于对低至100 pg的ChIP DNA进行测序采用增强型引物,可获得完整的基因组覆盖、最低的序列偏差、引物清除以及适用于二代测序的扩增子大小可兼容用于二代测序的Illumina、SOLiD TM或454文库制备。

应用^[4][5]

用于高通量测序技术在非小细胞肺癌基因检测中的应用研究

肺癌发病率最为常见的是非小细胞肺腺癌,部分基因的突变会导致肺癌的产生,如在部分患者中能检测到EGFR、BRAF、KARS等等基因发生突变。在现阶段临床可通过定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR）、非放射性原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,Fish）、多重引物PCR（multiplex PCR）等方式对患者进行相关位点的基因突变检测,这些技术存在一次只能检测一个基因或检测成本高等问题。二代高通量测序方法（Next Generation Sequence,NGS）,可有效的实现不同基因和不同药物作用位点的一次性检出。设计了一个含284个肺癌相关基因的探针,用于临床肺癌样本基因组DNA经过酶切打断后获得DNA文库的杂交捕获测序,进行非小细胞肺癌基因突变的临床检测。

在本研究存在4个优点:1)建库起始量降低至100ng;2)使用酶切建库发替代物理超声波打断法;3)能同时对单核苷酸位点变异（single nucleotide variants,SNV）、插入缺失标记（insertion-deletion,Indel）、融合基因（Fusion Gene）等不同突变类型进行检测;4)建库时间由3天缩短至1.5天;5)同时对比了BGISEQ-500测序仪与HISEQ-4000的数据,结果显示两者间的一致性极高,基于成本的考虑,我们选择了BGISEQ-500测序平台。

本研究对已有的85例样本,进行了EGFR基因L858R、T790M突变、E746-A750缺失、KRAS基因G12D突变和EML4-ALK融合基因的突变检测,并比较在双脱氧链终止法（sanger法）测序平台、突变扩增系统（amplification refractory mutation system,ARMS）平台、免疫组织化学技术（immunocytochemistry,IHC）平台的一致性验证,其符合度分别为94.1%、96.5%、95.3%、98.8%、100%,结果显示NGS检出结果与各平台结果均有良好的一致性。使用自配标准品（EGFRL858R、EGFR19exondel、KRASG12D、ALKFusion）进行10%、5%、3%、2%、1%、0.5%等频率的检测,个别基因最低可检出0.5%。

参考文献

[1]KRAS mutations in non-small cell lung cancer.Riely Gregory J,Marks Jenifer,Pao William.Proceedings of the American Thoracic Society.2009

[2]Genetic susceptibility to lung cancer—light at the end of the tunnel?.L.Marshall Ariela,C.Christiani David.Carcinogenesis.2013

[3]Translating genomic information into clinical medicine:lung cancer as a paradigm.Levy Mia A,Lovly Christine M,Pao William.Genome Research.2012

[4]Genome coverage and sequence fidelity of phi29 polymerase-based multiple strand displacement whole genome amplification.Paez J Guillermo,Lin Ming,Beroukhim Rameen,Lee Jeffrey C,Zhao Xiaojun,Richter Daniel J,Gabriel Stacey,Herman Paula,Sasaki Hidefumi,Altshuler David,Li Cheng,Meyerson Matthew,Sellers William R.Nucleic Acids Research.2004

[5]林木飞.高通量测序技术在非小细胞肺癌基因检测中的应用研究[D].华南理工大学,2018.