MAXUPMRNA建库试剂盒的应用

背景^[1-4]

MAXUPMRNA建库试剂盒是针对Illumina高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒MaxUp mRNA建库试剂盒cDNA二链合成模块配有两种buffer，可根据需要进行常规建库或链特异性建库。适用于起始模板为10 ng-1μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、链双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品zui终转化为适用于Illumina平台测序的文库。

试剂盒包含三个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的poly（A）磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性dscDNA合成所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。

MaxUp mRNA建库试剂盒适用于起始模板量为10-1000 ng（体积≤50μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50μL，可使用Hieff NGSTM RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Boanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。MAXUPMRNA建库试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo d(T)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的mRNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。

MAXUPMRNA建库试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括：

基因表达（gene expression）

单核苷酸变异检测（single nucleotide variation discovery）

基因融合鉴定（gene fusion identification）

剪切变异体分析（splice variant analysis）

应用^[5][6]

用于基于高通量Illumina测序技术的干旱胁迫下大豆根和叶mRNA表达谱研究农作物必须适应各种极端胁迫环境。大豆是一种重要的经济作物,其产量明显的受干旱胁迫影响,因此培育与耐旱相关的作物已成为当务之急。虽然目前在研究耐旱机理方面取得了一定的进展,但是耐旱的分子机制仍然不十分清楚。为了更好的理解大豆响应干旱胁迫的分子机制,同时克隆大豆中与干旱密切相关的干旱应答基因,研究旱碱1号大豆幼苗在干旱胁迫(含有2% PEG 8000的Hoagland培养液)下48小时根和叶的转录表达谱。基于前期的一些实验,我们通过高通量Illumina测序研究基因在转录水平的表达,同时应用生物信息学软件对测序结果进行分析。结果如下：

1.干旱胁迫下根和叶中分别有2956个和1620个差异表达基因。其中,根特异性差异基因2383个,叶特异性差异基因1047个,根叶共表达差异基因573个。

2.BGI WEGO软件对差异表达基因进行了主要生物学功能分类。干旱胁迫下所有差异表达基因中,描述基因细胞组件的有11类,描述基因分子功能的有12类,描述基因参与的生物过程的有16类。

3.通过cluster和javaTreeview软件,对根叶共表达差异基因进行了聚类分析,在逆境条件下表达相似的基因成簇的聚到一起。

4.通过对干旱胁迫应答基因的研究发现干旱胁迫下与核苷酸途径相关的一些顺式作用元件和反式作用因子基因表达上调,进一步对这些基因在分子水平上进行分析,表明这些基因处在ABA依赖和ABA非依赖两大调控网络中,同时这些pathway彼此之间相互联系。

5.应用Real-time RT-PCR方法验证分析了Illumina测序出的6个基因,结果表明这6个基因在干旱胁迫下表达量改变倍数和表达谱测序中获得的差异表达倍数基本一致,从而表明测序数据真实可靠。

参考文献

[1]Intronic Alternative Splicing Regulators Identified by Comparative Genomics in Nematodes[J].Jennifer L Kabat,Sergio Barberan-Soler,Paul McKenna,Hiram Clawson,Tracy Farrer,Alan M Zahler.PLOS Computational Biology.2006(7)

[2]Sequence analysis of mRNA polyadenylation signals of rice genes[J].Ying Lu,Chenxi Gao,Bin Han.Chinese Science Bulletin.2006(9)

[3]Cloning and sequence analysis of a low temperature-induced gene from trifoliate orange with unusual pre-mRNA processing[J].Y.Jia,H.S.Rio,A.L.Robbins,E.S.Louzada.Plant Cell Reports.2004(3)

[4]Characterization of the genes for two soybean aspartic proteinases and analysis of their different tissue-dependent expression[J].Kaede Terauchi,Tomiko Asakura,Naoko K.Nishizawa,Ichiro Matsumoto,Keiko Abe.Planta.2004(6)

[5]MECHANISMS OF ALTERNATIVE PRE-MESSENGER RNA SPLICING[J].Douglas L.Black.Annual Review of Biochemistry.2003

[6]范秀朵. 基于高通量Illumina测序技术的干旱胁迫下大豆根和叶mRNA表达谱研究[D].吉林农业大学,2011.