SEQPLEX RNA扩增试剂盒的应用

背景^[1-4]

SEQPLEX RNA扩增试剂盒用于全转录组扩增（WTA）的SeqPlex RNA扩增试剂盒，专用于帮助对小量或降解/高度片段化的RNA（如来自福尔马林固定的石蜡包埋组织样品FFPE的RNA）进行二代测序（NGS）。SeqPlex试剂盒可对这类RNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化RNA样品进行预扩增。SEQPLEX RNA扩增试剂盒可在进入常用深度测序平台工作流程之前为总RNA或分离后的mRNA提供一种扩增方法，在8小时或更短的时间内从低纳克至皮克级总RNA生成微克级的双链cDNA，适合对组织、培养细胞、福尔马林固定的样品或血清中分离的RNA（包括不含polyA尾的RNA）进行扩增，并同时保持未扩增样品中所发现的差异表达模式。

测序准备包括三个步骤。首先，用具有半简并3'末端以及指定通用5'末端的引物对样品RNA进行逆转录。随着DNA聚合进行，置换的单链可作为引物退火和延伸的新模板。接下来，由侧翼为单个通用引物序列的随机重叠片段组成的双链cDNA文库产物，在优化的PCR条件下扩增生成WTA（全转录组扩增）产物。从纳克级完整起始RNA开始，大部分的扩增产物大小范围为200至400 bp。对于受损的RNA和皮克级高质量RNA，可得到150至250 bp大小范围。最后，将SeqPlex扩增RNA与深度测序工作流程整合需要消除每个扩增子的引物序列。在样品制备之前需要完成有效的引物去除步骤。除了深度测序外，SeqPlex扩增产品还可适用于芯片靶标或qPCR模板——无论是否进行引物去除

应用^[5][6]

用于深度测序鉴定玉米病毒及感病玉米组织中小RNA分析

明确玉米病毒种类及生物学特性是防治玉米病毒病发生的关键。深度测序技术突破了传统病毒鉴定方法的局限性,能同时检测植物样品中已知的和未知的、含量高及含量低的所有RNA病毒、DNA病毒以及类病毒。这种新的测序技术极大地革新了植物病毒的检测方法,已成为目前病毒鉴定最为重要的前沿技术之一。

本研究利用小RNA深度测序技术鉴定了云南省和贵州省玉米病毒病的种类。通过contigs拼接和比对共鉴定了7种玉米病毒,分别为3种未知的RNA病毒并依次暂命名为：玉米黄化花叶病毒(Maize yellow mosaic virus,MYMV),玉米相关的形影病毒(Maize-associated umbravirus,MAUV)以及玉米相关的整体病毒1(Maize-associated totivirus1,MATV1);1种国内首次报道的DNA病毒：留尼旺玉米线条病毒云南分离物(Maize streak Reunion virus-YN isolate,MSRV-YN);3种已知的RNA病毒：玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV),甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV),南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)。

利用病毒来源的contigs以及小RNA设计引物,对上述3种未知的RNA病毒以及MSRV-YN进行了全长基因组的克隆。MYMV基因组全长5,642nt,共编码6个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),其ORF的大小及编码策略与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus,Luteoviridae)成员非常相似。全基因组核苷酸进化树分析以及6个ORFs的氨基酸序列进化树分析均显示MYMV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒成员聚为一簇,与该属成员玉米黄矮病毒-ⅠMV(Maize yellow dwarf virus-RMV)形成一个小的分支,具有最高的序列同源性,两者核苷酸序列相似性为73%,表明MYMV是该属的一个新的病毒成员。同时,构建了MYMV的全长cDNA侵染性克隆,RT-PCR及Northern blot结果均显示该侵染性克隆能成功地系统侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)。

参考文献

[1]Cadwell,Ken,et al.Virus-Plus-Susceptibility Gene Interaction Determines Crohn's Disease Gene Atg16L1 Phenotypes in Intestine.Cell 141,1135–1145(2010).

[2]Gonzalez-Roca,et al.Eva Accurate Expression Profiling of Very Small Cell Populations.PLoS ONE,5,e14418.(2010).

[3]Flynn,James M,et al.Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.The Journal of Visualized Experiments.

[4]Rowley,Anne H.,et al.Ultrastructural,Immunofluorescence,and RNA Evidence Support the Hypothesis of a“New”Virus Associated With Kawasaki Disease.J Infect Dis.203,1021-1030(2011).

[5]Sachsenröder,Jana,et al.Simultaneous Identification of DNA and RNA Viruses Present in Pig Faeces Using Process-Controlled Deep Sequencing.PLoS ONE,7,34631(2012).

[6]陈莎.深度测序鉴定玉米病毒及感病玉米组织中小RNA分析[D].浙江大学,2015.