STBL4感受态细胞的应用

背景^[1-3]

Stbl4菌株来源于Stbl2菌株（Stbl2为JM109衍生菌株），用于克隆不稳定序列（如重复序列，逆转录病毒序列等)和甲基化的DNA序列，特别适合构建重组逆转录病毒或慢病毒质粒。STBL4感受态细胞是克隆不稳定DNA的理想选择，可稳定直接重复序列和逆转录病毒序列，可以高效克隆甲基化基因组DNA，支持蓝/白筛选。STBL4感受态细胞的制备方法: Stbl4超级感受态细胞采用最新的二价锰法，Ultracompetent cell转化效率是常规氯化钙法的10倍。

Stbl4热激感受态细胞操作方法

1.Stbl4感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏70分钟。

当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率，则需37℃，225 rpm复苏60分钟

4.5000 rpm离心1分钟收集菌体，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上，平板倒置放于37℃培养箱过夜培养17-20小时或30℃培养箱过夜培养20-24小时。若转化control pUC19计算转化效率，则需37℃培养过夜。

5.若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基中30度摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：500ml三角瓶中加入100ml TB营养液，经30度250rpm摇菌，可提取约100-200ug PUC19质粒）

应用^[4][5]

用于高积累谷胱甘肽乳酸菌的分离、鉴定及重组工程菌的构建

谷胱甘肽(GSH)具有提高机体免疫力、清除体内自由基、解毒等重要生理功能,并在氨基酸转运、蛋白修复与合成、DNA合成等方面发挥着巨大作用。因而,筛选富含GSH菌株、挖掘新型双功能GSH合成酶(GshF)、构建高产GSH菌株,尤其是产GSH的乳酸菌工程菌株具有重要应用意义和经济价值。本研究以构建产GSH的益生性乳酸菌为目标,筛选得到了一株可富集GSH的乳酸菌,并通过微生物生理生化分析、分子生物学方法进行了菌株鉴定,通过克隆和表达该菌株潜在的谷胱甘肽合成酶基因验证了其潜在的GSH合成酶的功能,最后以该菌株为宿主构建了一株具备GSH合成能力的乳酸菌工程菌株。

主要结果如下：以内蒙古奶酪等为目标菌源,采用平板分离获取了一株富含GSH的乳酸菌,其胞内GSH含量高达6.14 mg·g4(细胞干重)。进一步通过菌株培养特征、生理生化指标考察及16S rDNA等技术,鉴定其为副干酪乳杆菌,并命名为Lactobacillus paracasei LHA4.为验证L.paracasei LHA4中潜在的GSH合成酶的功能,克隆获取了其的潜在的gshF,并分别构建了基于大肠杆菌及乳酸乳球菌的异源原核表达系统。序列分析表明GshFLp序列与Pasteurella multocida 2000及Streptococcus thermophilus CNRZ1066的GshF序列相似性分别仅为27%与25%；且GshFLp较具有催化活性的GshF短100余个氨基酸。

分别以pET-28a(+)及pNZ8148为表达载体并构建了重组表达工程菌株E.coli BL21/pET28a-gshFLp和L.lactis NZ9000/pNZ8148-gshFLp。实现了GshFLp于E.coli BL21和L.lactisNZ9000胞内的可溶性表达。然而,纯化于E.coli BL21的电泳纯蛋白和L.lactis NZ9000/pNZ8148-gshFLp的粗酶液均未检测到相应酶活；同时,结合L.paracaseiLHA4的粗酶液亦未能在含有ATP条件下将Glu、Gly和Cys三种前体氨基酸转化为GSH的现象,我们认为,依据生物信息学所推测的潜在的GshFLp不具备合成GSH的能力。为进一步提升菌株L.paracasei LHA4胞内GSH含量,以本研究室分离的一株具备GSH合成能力的Streptococcus thermophilus基因组为模板,克隆获取该菌株双功能GSH合成酶基因gshFst,将其构建至乳酸菌组成型表达载体pMG36e,并通过电击转化法导入L.paracasei LHA4感受态细胞中,获取工程菌株：L.paracasei LHA4/pMG36e-gshFSt。GSH测定分析表明,与野生菌株L.paracaseiLHA4相比,工程菌胞内GSH含量提升56%。

参考文献

[1]Antioxidant properties of potentially probiotic bacteria:in vitro and in vivo activities[J].Alberto Amaretti,Mattia Nunzio,Anna Pompei,Stefano Raimondi,Maddalena Rossi,Alessandra Bordoni.Applied Microbiology and Biotechnology.2013(2)

[2]Glutathione Biosynthesis in Bacteria by Bifunctional GshF Is Driven by a Modular Structure Featuring a Novel Hybrid ATP-Grasp Fold[J].Jan Stout,Dirk De Vos,Bjorn Vergauwen,Savvas N.Savvides.Journal of Molecular Biology.2012(4)

[3]Production of glutathione using a bifunctional enzyme encoded by gshF from Streptococcus thermophilus expressed in Escherichia coli[J].Wei Li,Zhimin Li,Jianhua Yang,Qin Ye.Journal of Biotechnology.2011(4)

[4]Crystallization and preliminary crystallographic analysis of bifunctionalγ‐glutamylcysteine synthetase–glutatione synthetase from Streptococcus agalactiae[J].Yasunori Nakashima,Hiroshi Nii,Blythe E.Janowiak,Owen W.Griffith,Takao Hibi.Acta Cryst.F.2009(7)

[5]刘婷婷.高积累谷胱甘肽乳酸菌的分离、鉴定及重组工程菌的构建[D].浙江大学,2015.