维拉卡肽对继发性甲状旁腺功能亢进的治疗

背景及概述^[1]

维拉卡肽，英文名Etelcalcetide、AMG416。之前报道中使用Fmoc-L-Cys(Npys)-OH、Boc-L-Cys(Npys)-OH、H-L-Cys(Npys)-OH等特殊的保护型氨基酸，由于其本身成本昂贵，在固相树脂上形成二硫键的方式存在用量过大、不易控制等不利因素，采用价格低廉的H-L-Cys-OH作为最后形成分子间二硫键的合成原料，采取几种简单的在液相中的氧化方法得到纯度较高的维拉卡肽粗肽溶液。不仅反应是在均相中完成，而且用量上得到了大大的减少与控制。

结构

应用^[1]

维拉卡肽是一种新颖的拟钙剂(CalcimimeticAgent)，该药通过静脉给药，开发用于正接受血液透析治疗的慢性肾脏病(CKD)患者。AMG416结合并激活对甲状旁腺上的钙敏感受体，从而导致实现甲状旁腺激素(PTH)水平的降低。在有效治疗继发性甲状旁腺功能亢进症的新型药物方面显示了广阔的前景。FDA批准新型拟钙剂维拉卡肽用于血液透析成年患者继发性甲状旁腺功能亢进的治疗，是12年来首个获批用于治疗透析患者继发性甲状旁腺功能亢进的药物。中重度甲状旁腺功能亢进血液透析患者接受维拉卡肽治疗后，PTH水平显著降低。而且维拉卡肽的疗效优于安慰剂、不低于西那卡塞。

制备^[2]

一种制备维拉卡肽的方法，如图所示，包括：

步骤一：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-RinkAmide-MBHA树脂的合成

称取替代度为0.502mmol/g的RinkAmide-MBHAresin50g为原料，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取36.0g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH(50mmol)和8.2g的HOBt(60mmol)溶于DMF溶液中，冰浴下加入22.8g的HBTU(60mmol)活化10min，再加入DIEA(17.4ml，100mmol)活化5min，再将活化液体加入固相反应柱中，室温反应6小时。用DMF洗涤3次，加入174ml封闭试剂(DIPEA/乙酸酐＝1：1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-RinkAmide-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.499mmol/g。

步骤二：Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂的制备(RinkAmide-MBHAresin)

称取步骤一中替代度为0.499mmol/g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-RinkAmide-MBHA树脂(25mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(50mmol)，Cl-HOBt(60mmol)，溶于DMF合溶液，冰水浴下加入HBTU(60mmol)和DIEA(75mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照维拉卡肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH、Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))的偶联，用DMF洗涤4次，DCM洗4次。得到Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂。

步骤三：维拉卡肽的制备

步骤二中的肽树脂置于裂解反应瓶中，以10mL/g树脂的比例加入裂解试剂，裂解试剂为TFA/PhSMe/EDT/TIS/H2O＝83：5：5：5：2，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水甲基叔丁基醚沉淀，用无水甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即维拉卡肽粗品28.6g，纯度为88.2％。

步骤四：维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的制备

称取步骤三种任意25.0g维拉卡肽粗品用10L水溶解后，采用汉邦(DAC-HB80)，波长230nm，色谱柱为80×250mm反相C18柱，常规0.2％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.8％精肽。将精肽溶液采用汉邦(DAC-HB80)，色谱柱为80×250mm反相C18柱，0.1％三氟乙酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到维拉卡肽盐酸盐精肽16.8g，计算总收率为57.8％，RP-HPLC纯度为99.364％。

主要参考资料

[1] CN201710678242.X一种维拉卡肽的合成方法
[2] CN201811277081.4一种制备维拉卡肽的方法