胰肽的应用

背景^[1-3]

胰肽是36个氨基酸组成的直链多肽激素，由胰腺的PP细胞分泌。PP细胞受餐后食物中蛋白质的作用，蛋白质是刺激PP分泌的最强因素，其次是脂肪、糖类。PP的释放均为迷走-胆碱能依赖性的，受迷走神经调节并可被迷走神经干切除术和抗胆碱能药物所抑制。十二指肠酸化、内源性CCK释放，可以作为刺激PP释放的主要激素，使PP值显著升高。

胰岛素使PP升高是通过低血糖兴奋迷走神经所致。生长激素可抑制PP释放和餐后PP水平。PP具如下生理效应：①抑制胆囊收缩素和胰酶的排放，使胆囊平滑肌松弛，可降低胆囊内的压力，胆总管括约肌紧张加强，抑制胆汁向十二指肠的排放。②各种食物进人小肠对PP释放有刺激作用，PP的生理作用是抑制餐后胰液和胆汁分泌，对胰泌素和胆囊收缩素等外源性促胰腺分泌的作用，PP均为较强的抑制剂。③PP对胃肠道有广泛作用，对五肽胃泌素引起的胃酸分泌的抑制作用。④PP抑制血浆胃动素的分泌，增加食管下括约肌的压力，抑制胃体部肌电活动。

胰多肽基础水平与年龄有关，随年龄增长升高，这种现象被认为与迷走神经紧张性增加有关。男性高于女性，肥胖者PP基础值和餐后值低于正常。

应用^[4][5]

用于聚乙二醇化重组人生长激素的制备、纯化、理化性质以及生物活性研究。

单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD,20KD)修饰重组人生长激素(rhGH)的最适反应条件以及修饰产物的纯化方法;并以目标产物——单聚PEO-rhGH为研究对象,对其相对分子量、纯度、等电点、修饰位点、二级结构、分子构象、体外受体亲和力以及体内生物学活性进行了研究。方法:用SDS-PAGE分析不同反应条件对修饰反应产物的影响;用离子交换及分子筛进行分离纯化;通过分子筛高效液相(Size Exclusion HPLC)、毛细管等电聚焦(CIEF)、圆二色谱(CD)、质谱、以及荧光光谱等方法对单聚PEG-rhGH的纯度、等电点、二级结构、相对分子量、修饰位点以及分子构象进行了研究;采用妊娠兔肝细胞膜放射受体分析法(RRA)检测单聚PEG-rhGH的体外受体亲和力;利用未成年去垂体大鼠体重增加法检测单聚PEG-rhGH的体内生物活性。

结果:通过筛选,选定pH6.0,rhGH与mPEG-ALD质量比1:8,反应时间16h为修饰条件。在此条件下,单聚PEG-rhGH的比例可达77.8%;经两步分离纯化,目标产物单聚PEG-rhGH的得率达到52.9%。样品在分子筛高效液相图谱上仅出现一个峰,纯度大于98%;CIEF测定单聚PEG-rhGH的等电点为5.2,这与未修饰的rhGH的等电点相一致;质谱扫描法测定结果表明单聚PEG-rhGH的相对分子量为43KD,与理论值基本相符;胰肽图谱表明在修饰过程中聚乙二醇丙醛选择性的与蛋白分子N末端(苯丙氨酸)α氨基相偶连;CD谱与荧光光谱均表明单个mPEG-ALD的修饰对rhGH的二级结构以及分子构象没有明显影响;与未修饰的rhGH相比,单聚PEG-rhGH体外受体亲和力降低了4.97倍;体内活性测定结果表明单聚PEG-rhGH的体内作用时间更长且更加有效。

结论:确立了单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰重组人生长激素的最适反应条件以及修饰产物的纯化方法。

参考文献

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[3]Long-acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol.Ross Clark,Kenneth Olson,Germaine Fuh.Journal of Biological Chemistry.1996

[4]NEW PEGs for protein modification,suitable for identification of the PEGlyation Site.Hinds K,koh J,Joss L.et al.biocinju Chem.2001

[5]魏练平.聚乙二醇化重组人生长激素的制备、纯化、理化性质以及生物活性研究[D].安徽大学,2005.