食品添加剂乳酸链球菌素的作用机理和安全性

乳酸链球菌素又称为乳链菌肽，简称为Nisin，是由牛奶和奶酪中天然存在的乳酸链球菌发酵产生的一种天然生物抗菌肽，具有广谱抗菌作用，能有效抑制大部分革兰阳性菌及其芽孢的生长和繁殖。特别是对常见的金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌等细菌抑制作用明显，对很多食品能起到防腐、保鲜作用。而且乳酸链球菌素稳定性较好，耐热耐酸，在食品工业中具有很好的应用前景。

乳酸链球菌素是一种世界公认的、安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂，主要用于乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鲜。乳酸链球菌素的发现要追溯到上世纪20年代，1928年，LA.Rogers等美国研究人员首先报道了乳酸链球菌代谢产物能抑制其他乳酸菌的生长。1947年，A.T.R.Mattick等人发现血清学N群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质，并从乳酸链球菌发酵液中制备出了这种多肽物质，由于是N群中的乳酸菌所产生的抑菌物质，故命名为N-inhibitory Substance，即N群抑菌物质，简称为Nisin。

白色乳酸链球菌素粉末

Nisin是乳酸链球菌的一种天然产物，对远超过食品应用量的乳酸链球菌素的毒性研究表明，它是无毒的。由于其对蛋白水解酶(α-胰蛋白酶)特别敏感，因此食用后在消化道内即可很快被蛋白水解酶水解成氨基酸。1953年，乳酸链球菌素的批商业产品Nisaplin在英国面市;1969年，FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会批准乳酸链球菌素可作为一种食品添加剂;1988年，美国食品和药物管理局(FDA)也正式批准将乳酸链球菌素应用于食品中;1990年，我国卫生部食品监督部门签发了乳酸链球菌素在中国的使用合格证明书。目前已有50多个国家批注允许使用乳酸链球菌素。
 

乳酸链球菌素的抑菌范围

乳酸链球菌素能够有效抑制或杀死引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌，浓度为100ppm时就可以杀死大多数的革兰氏阳性菌，能抑制葡萄球菌属、链球菌属、乳杆菌属及微球菌属的某些菌种;对大部分的梭菌属和芽孢杆菌属及其芽孢也有明显的抑制作用。Hitchins，A.D等研究表明，杆菌属中的嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢对Nisin最为敏感，极少量的Nisin即能够杀死其芽孢，Nisin对芽孢的作用是在孢子膨胀起始阶段抑制其萌发，而不是杀死。

由于Nisin抗菌谱窄，仅能杀死或抑制革兰氏阳性菌，而对于革兰氏阴性菌、霉菌和酵母菌则无明显作用，故使其应用受到限制，将Nisin与其他防腐剂配合使用可以弥补这一缺点，进而发挥广谱抑菌作用。有研究表明，Nisin与其他防腐剂联合使用能增强自身的抑菌作用，可获得较宽的抑菌谱。Nisin和乳酸合用能抑制肉中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。Nisin与螯合剂(如EDTA)联合使用，对沙门氏菌具有一定的抑制作用，并能够有效减少其他G-菌的数量。此外，Nisin与磷酸盐、柠檬酸盐合用也能提高其对G-菌的抑制效果。

乳酸链球菌素分子结构式

乳酸链球菌素的抑菌机理

研究表明，Nisin是一个疏水、带正电荷的小肽，它能够吸附在革兰氏阳性敏感菌的细胞膜上，与细胞壁中带负电荷的物质(如磷壁酸、糖醛酸、酸性多糖或磷脂)作用，能够通过C末端的作用侵入到细胞膜中形成通透孔洞，抑制革兰氏阳性菌细胞壁的合成，改变细胞膜的通透性，引起细胞中的小分子物质流出，同时，细胞外水分子流入，最后导致细胞自溶死亡。

Nisin对许多G+菌有抗菌活性，但对G-菌、酵母菌和霉菌没有作用。对比G+细菌和G-细菌的细胞壁，可以发现G+菌的肽聚糖层明显比G-菌厚得多，而G-菌的细胞壁组成比较复杂，主要包括蛋白质、磷脂和脂多糖等，十分致密，仅能允许分子量在600Da以下的小分子通过，而Nisin分子量约为3510Da，所以无法通过致密的细胞壁，因此，Nisin就不能到达细胞膜进而发挥杀菌作用。为了进一步证实这一说法，Steven及Kordel等研究报道，经过处理改变G-菌的外壁的透过性质之后，G-菌也对Nisin变得敏感，也可以被抑制或杀死。这就有力证明了G-菌对Nisin不敏感是因为细胞壁太厚，Nisin分子进不去。在Nisin杀菌过程中，其分子中所含的稀有氨基酸对Nisin的作用方式很大，对这一问题的研究进行得相当活跃，主要是通过蛋白质工程的手段，定向改变Nisin分子中一个或一段氨基酸的组成，以对其功能进行研究。对这一领域的研究将使人们进一步了解Nisin的作用机制，以便扩大应用范围或增强作用效果。

乳酸链球菌素的安全性

乳酸链球菌素是一种天然的多肽物质，食用后可被人体内的蛋白酶(如胰蛋白酶、胰酶、唾液酶等)消化分解成氨基酸，无微生物毒性或致病作用，因此其安全性较高。

1956年，英国食品防腐剂委员会证实了在牛奶和干酪中自然存在有不同数量的乳酸链球菌素;1962年日本的Hara等证实乳酸链球菌素对小白鼠的半致死量LD50约为7g/kg bw，与普通盐的LD50值相近;英国和前苏联的商业部门对其生产的乳酸链球菌素进行了广泛的毒性和生物学研究，包括致癌性、存活性、再生性、血液化学、肾功能、脑功能、应激反应及动物器官病理学等诸多方面研究证明，Nisin是安全的。通过毒理学试验证明，乳酸链球菌素小鼠经口急性毒性：雌性小鼠LD50为6.81g/kg bw，雄性小鼠LD50为9.26g/kg bw，属于实际无毒性。乳酸链球菌素大鼠经口急性毒性：雌性大鼠LD50为6.81g/kg bw，雄性大鼠LD50为14.70g/kg bw，属于实际无毒性。结果表明：乳酸链球菌素是安全的。美国联邦法规规定已将乳酸链球菌素列为“一般公认为安全的(GRAS)”范围。1992年3月，我国卫生部在批准实施的文件中就明确指出：“可以科学地认为乳酸链球菌素作为食品保藏剂是安全的”。目前全世界已有近50个国家制定了法律规定乳酸链球菌素作为食品防腐剂的使用范围和极限使用量，而英国、法国、澳大利亚等20多个国家则没有限量使用的规定。

乳酸链球菌素的用途

一、在乳及乳制品中的应用
1．国产Nisin最先在高温灭菌乳（UHT）中应用成功。通常，UHT乳是采用超高温瞬时灭菌，经无菌包装而成，无需添加食品防腐剂。但在炎热的夏季，原料乳的质量，往往难以保证，结果因有较多的微生物残留，导致坏包率增加（出现酸包和胀袋等）。添加Nisin可以使UHT乳坏包率大幅度下降，保持期延长。
2．在二次灭菌乳中的应用。生产二次灭菌乳多为中小乳品企业，产品属中低档。鲜乳需经较长时间的二次加热灭菌，导致非酶褐变的产生，产品色泽变深。添加Nisin牞可以降低灭菌强度，降低非酶褐变的进程，又可以延长产品的保质期。
3．在巴氏消毒乳中的应用。据报道，去年8月份，上海市场上巴氏消毒乳合格率仅为73．37％，出厂时的合格产品，经配送站再分送到消费者手中，因无冷链支持（无冷链状态的时间最长为8小时），导致加工乳的品质严重下降，大肠菌群超标。添加Nisin可以提高巴氏消毒乳食用的安全性。
4．在鲜乳中的应用。据国际新标准GB5408．2－1999规定，对超高温灭菌乳和二次灭菌乳，均不得添加食品防腐剂。为此，必须提高原料乳（鲜乳）的质量，严格控制原料乳中的微生物指标。按农业部颁布的无公害食品标准，每毫升鲜乳中，菌落总数应小于50万个。但据山东某乳品厂反映，除直属牧场可以得到控制外，400公里以外、5～6小时冷藏车运输的鲜乳，菌落总数就会大大超标。又据内蒙古某奶站报告，即使集中采乳，机械降温，冷藏车运输，乳温控制在4～6℃，夏天不超过10℃，每毫升原料乳的菌落总数仍在100～200万个范围之内，达不到标准规定的指标。
另外，在原料乳中不能使用化学防腐剂，个别农户为防止鲜乳变质、腐败，加甲醛防腐，更是严重违规、违法的行为。若添加Nisin，可以使鲜乳保质、达标（因Nisin在某些鲜乳中就有天然存在）。
5．在酸乳中的应用。含有活性乳酸菌的酸乳，在保质期内，乳酸菌还能进行缓慢发酵，致使酸乳的酸度继续升高。结果是，酸乳口味变劣，消费者不能接受。添加Nisin，可以抑制酸乳发酵酸度的继续升高。
在酸乳中的添加方式，可以采用主发酵前或主发酵后添加。以何种添加方式为妥？这要根据产品的品种和工艺来决定。若在主发酵前添加，必须严格控制Nisin的添加量。因为，Nisin对酸乳的生产菌种有抑制作用，使发酵时间延长。判断的标准是，添加Nisin后，酸乳的主发酵时间应在3～6小时以内结束属正常。若主发酵时间超过6小时，应减少Nisin的添加量。由于酸乳品种繁多，各种酸乳的具体应用情况，就不一一作介绍了。

二、在肉制品中的应用
国产Nisin最先在高温肉制品中应用取得成功。然后，在低温肉制品中也得到有效的使用。到目前为止，不论何种包装形式（软包装、罐装、瓶装、肠衣灌制），不论何种加工方法（腌、腊、酱、熏、卤、糖醋、干制）的禽类（鸡、鸭、鹅）、肉类（猪、牛、羊、兔）、鱼虾类等制品中应用，都取得了比较理想的效果。
因肉制品营养物质丰富，且水分活度大，pH又偏中性，各种有害微生物，如细菌、霉菌、酵母都能生长繁殖。为扩大抑菌范围，增强防腐效果，应选用Nisin的复合产品，而不能采用纯品Nisin。所谓复合添加剂，是指由两种以上单一品种的添加剂经物理方法混合而成。通常，直接由生产单位提供，有条件的客户也可自行复合。
现在，复合产品一般按下列三原则研制而成：
①复合产品中的各成分都是国家批准使用的品种。
②为方便客户使用和便于运输，固体品种不和液体品种复合，也没有复合的液体产品。一般都是固体的复合添加剂。若客户自行复合，则不受此原则的限制。
③为提高食品的安全质量，天然食品防腐剂不与化学防腐剂复合，但山梨酸除外。因为，山梨酸是一种不饱和脂肪酸，基本上和天然不饱和脂肪酸一样，可以在机体内被同化，产生二氧化碳和水。故山梨酸可以看成是食品的一种成分。可以认为对人体是无害的。
有资料显示，Nisin与螯合剂如EDTA共同作用，对格兰氏阴性菌也抑制作用。这样，就扩大了Nisin的抗菌谱。EDTA是乙二胺四乙酸的二钠盐，由乙二胺、氰化钠和甲醛水溶液作用，再与氢氧化钠反应而制得。国标规定，仅允许在部分罐头食品中使用。为安全计，某企业曾拒绝使用含EDTA的复合添加剂，也不无道理。若选用螯合剂葡萄糖酸－δ－内酯，就具有更大的安全性和优越性，此有机酸是机体糖代谢的一个中间产物。因此，可以认为，对人体是无害的。葡萄糖酸－δ－内酯还有降低肉制品pH的作用，可以增强发色剂和防腐剂的效果。另外，它还可以降低肉制品的水分活度，本身就是一种优良的食品防腐剂。

三、在罐头食品中的应用
在罐头食品中添加Nisin有许多优点：
①可以降低热处理的强度，减少食品营养成分的损失，改善产品的食用品质。
②抑制耐热细菌芽孢的生长和繁殖，延长食品的保藏时间。目前，主要在一些果蔬类罐头中应用，以降低灭菌强度，使果蔬类罐头有较好的组织脆度和食用品质。

四、在植物蛋白食品中的应用
盒装内酯豆腐，在炎热的夏季，保质期不到12个小时。超过12小时，产品就会脱水、变酸、变质。添加Nisin，保质期可以延长到24小时。1天的保质期，安全可以满足这种即食产品在市场上流通的需要。如对保质期还有更高的要求，根据北京农大王绍林老师的研究，添加Nisin再配合微波杀菌，在室温18℃下，保质期可以达到3天。
五、在饮料中的应用
在饮料中添加Nisin可以抑制耐酸、耐热细菌（如酸土芽孢杆菌）的生长和繁殖，防止饮料的酸败，延长产品的保质期。目前，已在饮料生产中应用的饮料品种有果汁饮料、醋酸饮料、芦荟饮料、含乳饮料、保健饮料（如人参饮料、枸杞菊花饮料）等。
六、在酿造酒中的应用
利用Nisin不抑制酵母发酵这一特性，可将它用于啤酒、黄酒、葡萄酒等含酒料饮料的酿造，以防止乳酸菌引起酒的酸败和其他的病害。在啤酒、黄酒的酿造中，目前，主要应用于啤酒酵母、黄酒酵母的扩大培养，以防止杂菌的感染。对低度黄酒，常因杀菌不彻底、包装容器不洁，或因密封不良，酒精度低等原因，在储藏期间导致黄酒发酸变质。添加Nisin，可以有效地防止黄酒的酸败，延长保质期。
七、在方便食品中的应用
在小包装休闲方便食品中，如鸡腿、鸡爪、肉干等禽肉制品，已概括在“肉制品中的应用”一节作了阐述，这里不再重复。蔬菜类的方便食品，如低盐榨菜、金瓜丝等也都在生产中正常使用。