HB101感受态细胞的应用

背景^[1][2]

HB101感受态细胞是采用HB101菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。HB101菌株是E.Coli K12菌株和E.Coli B菌株的杂合产物（同时也是Stbl3的原始菌株）。recA13突变可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；但不含核酸酶endA1突变，体内核酸酶含量较高，提取质粒时务必使用质粒提取试剂盒中去蛋白液。hsdS20背景使HB101缺失内切酶系统，增强了外源DNA的稳定性和提取质量；此菌株具有链霉素抗性；不存在lacIqZΔM15，不可用于蓝、白斑筛选。

HB101感受态细胞绝大部分基因来源于K112菌种，它能被质粒有效的转化，故常用于质粒的大量制备。它具有下列特点：

1.三个重组途径均缺失，故重组效率极低，尤其适合制备有回文结构的高拷贝质粒。

2.携带琥珀抑制基因，故允许有琥珀突变的质粒和噬菌体生长。

3.Eco甲基化修饰和限制系统缺失，可用甲基化和非甲基化的质粒转化，得到的质粒均为非甲基化。

4.菌种具有链霉素和2-脱氧半乳糖抗性。

基因型

F- mcrB mrr hsdS20(rB-mB-)recA13 leuB6 ara-14 proA2 lacY1 galK2 xyl-5 mtl-1 rpsL20(SmR)glnV44λ-

操作方法

1.HB101感受态细胞放手心或室温片刻，待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰上静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基（2YT或LB），混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100ul左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

应用^[3]

用于RNAi沉默SMC1A对肺癌A549及H1299细胞生长的抑制作用研究

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤，在全球范围内严重危害着人类的健康。尽管手术技术和其他传统的治疗方法，如化疗和放射治疗在不断取得重大进展，但大多数肺癌患者的预后依然面临着巨大威胁。因此，了解肺癌发生过程中的分子机制对于开展更有效的诊疗手段显得极为重要。基因组不稳定性被认为是肿瘤细胞的特异性标志，在肿瘤发生过程中具有重要作用。而最近在酵母细胞的研究中发现的Cohesin复合体因其与肿瘤细胞基因组不稳定性密切相关，目前受到了学界广泛关注。

从酵母细胞到人类的体细胞，Cohesin复合体在进化过程中呈高度保守，其构成包括：一对SMC（结构维持染色体）蛋白，即SMC1A的、SMC3，和两个非SMC蛋白质，RAD21/SCC1和STAG/SCC3/SA等四个亚基。SMC1A和SMC3组成两个螺旋域，并通过它们的铰链域（hinge domain），形成反向平行的异二聚体。他们的头域（head domain）则分别与RAD21相互作用，创建一个环状结构。通过该环状结构Cohesin复合体不仅可以捕获DNA，调控姐妹染色单体在S期的复制，而且在分裂后期姊妹染色体分离时，可以确保其精确分离，从而维护基因组稳定性。目前已有多项实验研究证实Cohesin复合体在DNA修复，细胞周期调控，基因转录调控和基因组印记等细胞生物活动中扮演着重要角色。

shSMC1A-pFH1UGW重组质粒的构建及慢病毒包装搜索GeneBank中SMC1A的已知mRNA序列（NCBI Reference Sequence:NM006306.2），针对该序列设计一对正反向oligo，其正向序列为5’-TAGGAGGTTCTTCTGAGTACA-3’；在Annealing Buffer中退火，是其形成双链结构。选用适宜的多克隆位点，应用双酶切体系以进行质粒酶切。T4Ligase进行供体和载体的定向连接，并将连接产物转化于HB101感受态细胞内，隔日进行Amp抗性筛选。经PCR鉴定后挑取阳性克隆进行测序。构建阴性对照组的重组质粒

参考文献

[1] 张坤.突变的人胰岛素原基因逆转录病毒重组质粒的构建及鉴定[D].中国医科大学,2002.

[2] 王丹.大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的构建及转化[D].吉林农业大学,2012.

[3] 张一帆.RNAi沉默SMC1A对肺癌A549及H1299细胞生长的抑制作用[D].吉林大学,2013.