血栓调节蛋白抗体的应用

背景^[1][2]

血栓调节蛋白抗体是用血栓调节蛋白对异种无菌动物进行系统免疫使其体内产生的一种特异性结合血栓调节蛋白的免疫蛋白。血栓调节蛋白（Thrombomodulin，TM）:与凝血酶结合后可降低凝血酶的凝血活性，而加强其激活蛋白C的活性。由于被激活的蛋白C具有抗凝作用，因此，TM是使凝血酶由促凝转向抗凝的重要的血管内凝血抑制因子。

TM为一单链的跨膜糖蛋白,相对分子质量75000,降解二硫键后相对分子质量为105000。其基因定位于第20对常染色体,含有18个外显子,无内含子,长度为3.7kb,能转录碱基1725bp,其表达产物由575个氨基酸组成。TM最初发现于血管内皮细胞。免疫组织化学染色证明,约99%以上的血管内皮细胞表达TM,每个内皮细胞有(0.3～1.0)×105个TM分子。最近研究发现,TM亦存在于胎盘滋养层细胞、血小板、巨核细胞、单核细胞、中性粒细胞、滑液层细胞、角化细胞、脑膜细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞。TM有两种存在形式:固定型(膜型)和溶解型(血液型)。前者存在于细胞表面,后者游离于血浆和尿液中。血浆及尿液中的TM相对分子质量大小不同。在正常人的血浆和尿液中检测到溶解型TM,经SDS2PAGE分析见其相对分子质量比固定型小。TM在调节血栓形成过程中作用是极其复杂的,它在不同水平通过不同机制调节机体凝血与抗凝血的平衡,并可作为细胞黏附分子的一员,参与调控肿瘤细胞的增生和侵袭。

应用^[3][4]

用于抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备及初步应用研究

建立稳定表达人血栓调节蛋白（hTM）的克隆细胞株,制备抗hTM单克隆抗体（McAb）,为心血管疾病的研究提供基础。

方法:（1）重组表达质粒pThr402提纯后经lipofectamine脂质体转染CHO,经G418筛选,流式细胞术及Western blotting检测,获得稳定高表达hTM的克隆细胞株CHO-TM。

（2）采用CHO-TM细胞作为免疫原,免疫Balb/c雌性小鼠,按常规方法融合并经CELISA法筛选,制备稳定分泌抗人血栓调节蛋白MaAb的克隆细胞株,并对McAb的亚类、免疫活性、细胞与组织特异性及识别抗原特异性进行鉴定。

（3）收集动脉粥样硬化病人血标本,将抗人血栓调节蛋白McAb应用于Western blotting检测病人的sTM水平。

结果:（1）成功获得了稳定、高效表达hTM的克隆细胞株CHO-TM1、CHO-TM3～6。其中CHO-TM6的表达量最高,阳性细胞百分率与平均荧光强度分别为89.00%和9.84。

（2）成功制备了抗人血栓调节蛋白McAb,命名为NH-1。琼脂糖免疫双扩散法鉴定NH-1的重链为IgGl亚类。CELISA法测定其腹水效价为5×10-5,M750-B紫外分光光度仪测定腹水抗体含量为20mg/ml。流式细胞仪检测该抗体与CHO-TM6和HUVEC呈阳性反应,与CHO及正常人外周红细胞、白细胞、未活化血小板呈阴性反应。ABC免疫组织化学法检测正常人组织切片显示其该抗体除与子宫和前列腺有交叉反应外,与小肠、胸腺、脾、甲状腺、胆囊、卵巢、膀胱、肝脏、肾脏、胃等组织呈阴性反应,各组织中的血管内皮细胞均有hTM表达。Western blotting分析显示McAb NH-1可特异地识别还原条件下相对分子量为105KD左右的蛋白多肽。（3）McAb NH-1可用于Western blotting检测动脉粥样硬化病人的sTM水平。

结论:（1）获得了稳定、高效表达hTM的克隆细胞株CHO-TM1、CHO-TM3～6;（2）制备了一株具有较高免疫活性和细胞、组织特异性的抗人血栓调节蛋白McAb NH-1,并成功用于动脉粥样硬化病人sTM水平的Western blotting检测。

参考文献

[1] Association of Thrombomodulin Gene Polymorphisms with Susceptibility to Atherosclerotic Diseases:A Meta‐Analysis[J].Jie Xu,Jun Jin,Sheng Tan.Annals of Human Genetics.2016(3)

[2] Heart failure and risk of venous thromboembolism:a systematic review and meta-analysis[J].Liang Tang,Ying-Ying Wu,Gregory Y H Lip,Ping Yin,Yu Hu.The Lancet Haematology.2016(1)

[3] 抗重组人表皮生长因子单克隆抗体的制备及临床应用初探[D].罗萍.第三军医大学2004

[4] 朱海燕.动脉微栓塞组织病理及血栓调节蛋白变化的实验研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2005.