植物基因组DNA提取试剂盒(CTAB粗提法)的操作方法

概述^[1][2]

植物基因组DNA提取试剂盒(CTAB粗提法)可用于简单快速提取植物基因组DNA，先将新鲜植物样本研磨破碎细胞壁，加入CTBA抽提液使细胞膜破裂同时将核酸与植物多糖等杂质分开。

操作方法^[1][2]

1．现场使用正压过滤装置，用0．22um(150cm)混合纤维膜的过滤2L水样(蓝藻群体颗粒用滤膜除去过多水分)，抽滤结束后，将滤膜剪碎并至于50ml离心管中，如果不能及时分析，-20°C保存。

2．在50ml离心管中加入4ml溶液A(50mM Tris-C1+50mMNa2EDTA+1M NaCl)，然后加10％(十二烷基肌氨酸钠)溶液至终浓度为0.1％Sarkosyl，加入十六烷基三甲基溴化铵CetylTrimethylAmmoniumBromide至终浓度为2％。

3．取适量样本加入上述离心管，振荡混匀3min，然后在4°C下保存lh。

4．以8,000rpm离心15min，弃液体；用1.5ml溶液B(50mM Tris-C1+50mM Na2EDTA+ImMNaCl)处理样本两次(处理方法如下：加入1.5ml溶液B，振荡混匀3min，转移到2ml离心管中，8,000rpm离心15min，弃液。再加入1.5ml溶液B洗涤一次)，将细胞重新悬于250ml溶液C(50mM Tris-C1+50mMNa2EDTA+25％蔗糖)，室温放置1h。

5．加入溶菌酶(100mg／m1)至终浓度为10—20mg／ml，并于37°C保温15min，用750ul缓冲液D(10mMTris-C1+50mMNa2EDTA)稀释细胞悬液，并再于37°C保温30min；加入10％SDS至终浓度1，小心搅匀，继续37°C保温1h，直至悬液变粘。

6．加入蛋白酶K(10mg／m1)至终浓度100ug／ml，再于37°C保温2h。

7．用酚／氯仿(25：24)抽提一次(分2管加入2ml离心管，因为加入酚／氯仿5min，吸上清)，用2倍体积的无水乙醇沉淀核酸，4。C放置1h或过夜；以(12，000rpm30mkn)离心沉淀核酸并晾干(15-20min)。

8．将沉淀溶于150ulTE缓冲液中，加入Rnase(10mg／ml至终浓度100ug／ml消化RNA，37°C保温1h，然后用酚／氯仿(25：24)抽提一次(10，000g离心5min，吸上清)，再用氯仿抽提一次(10，000g离心5min，吸上清)，加入5M NaCl至终浓度为1M，并用2倍体积的冰冷乙醇沉淀DNA，4°C放1h或过夜，再次以(12，000rpm30min)离心沉淀DNA，并将其溶于100ul的TE缓冲液中。如果样本浓度过低，可以加50ulTE溶解，定量后再决定是否要补加TE。使用NanoDrop进行质量检测。

9．质检结果不理想的样本，用PowerClean⑩DNAClean-Upkit进行纯化。

10．提取好的DNA置于-20°C保存。

主要参考文献

[1] 雷娅红 进境多年生黑麦草和白三叶种带真菌多样性研究 兰州大学 硕士生学位论文。

[2]  张军毅  太湖蓝藻水华的宏基因组学研究 东南大学 博士学位论文。