全反式维甲酸对抗肾小球基底膜肾炎小鼠模型肾脏损害的保护作用

新月体肾炎是各型肾炎中预后最差的一种类型，临床进展十分迅速，若不及时进行诊断和治疗，多数患者将于数周至数月内进展至终末期肾衰竭或死亡。其病理主要表现为大量新月体形成，肾小球或肾间质内大量以单核、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润［1］。全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)是维甲酸的衍生物，对调节细胞增殖、分化、凋亡、免疫及炎症反应起重要作用［2-3］，但维甲酸对新月体肾炎的作用和机制尚不十分清楚。肾毒性血清肾炎模型（nephrotoxicserum nephritis，NTSN），又称为抗肾小球基底膜肾炎模型，表现为新月体形成、大量炎症细胞浸润、肾小球基底膜破坏，是新月体肾炎研究最常用的模型［4］。因此我们在本研究中拟探讨全反式维甲酸对NTSN的作用和机制。

材料与方法

一、主要实验材料

野生型C57BL/6J小鼠购自杰克逊实验室。肾毒性血清（nephrotoxic serum， NTS）冻干粉剂由美国波士顿医学院David J. Salant教授惠赠。羊免疫球蛋白（杰克逊免疫研究实验室013-000-003）、完全弗氏佐剂（Sigma-F5881）、全反式维甲酸（sigma公司）、尿白蛋白ELISA检测试剂盒（Bethyl Laboratory）、尿肌酐检测试剂盒（DICT-500,Bioassay Systems）、血清尿素氮检测试剂盒（BioAssay Systems）、CD8淋巴细胞单克隆抗体（Biolegend 100703）、CD4淋巴细胞单克隆抗体（Abcam ab25475）、CD68单核/巨噬细胞单克隆抗体（Abcamab5344）、Alexa Fluor 568标记的山羊抗大鼠IgG（Thermo Fisher Scientific）、Trizol (Thermo Fisher Scientific)、CDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）、SYBR PCR试剂盒（Applied Biosystems)。

二、模型建立［5］

15只野生型C57BL/6J小鼠，随机均分为对照组、NTS组、NTS+维甲酸处理组。使用无菌PBS溶解NTS冻干粉末至终浓度为67mg/ml。0.5 mg羊IgG和45 μl完全弗氏佐剂腹腔注射预处理。全反式维甲酸溶于花生油和5%二甲亚砜，预处理后24 h给予全反式维甲酸16 mg/kg腹腔注射，对照组腹腔注射溶媒，每天注射一次，直至处死小鼠。预处理5 d后予100 μl NTS尾静脉注射构建肾毒性血清肾炎模型，对照组注射100 μl PBS。NTS注射7 d后处死小鼠。

三、组织标本的收集

小鼠麻醉后仰面固定于操作台，暴露腹腔，下腔静脉取血、膀胱取尿后，从心脏进针建立静脉通道，使用PBS灌注5 min后取下双侧肾脏，将肾脏对切，一半肾组织样本用于提取RNA-80℃保存。一半肾组织福尔马林固定，石蜡包埋后行组织切片（4 μm）；一半肾组织OCT包埋后行冰冻切片（4μm）。

四、蛋白尿和血清尿素氮检测

根据尿白蛋白检测试剂盒说明和尿肌酐检测试剂盒说明分别检测小鼠尿白蛋白、尿肌酐，取两者的比值，得到尿微量白蛋白/肌酐（urinary microalbumin/ creatinine ratio,UACR）。根据商品化试剂盒说明检测小鼠血清尿素氮浓度。

五、肾脏组织病理学分析［6］

石蜡组织切片行HE染色，对肾脏的损害程度采用百分比评分法进行评估，即观察整个肾切片所有的肾小球，计算合并有新月体的肾小球数量、节段硬化的肾小球数量，除以肾小球数量的总和，得到百分比。

六、免疫荧光染色［6］

肾脏组织冰冻切片在预冷的丙酮溶液中固定15 min，PBS洗3遍，封闭液（含2%BSA、10%的山羊血清）室温孵育1h，然后分别使用CD8淋巴细胞单克隆抗体、CD4淋巴细胞单克隆抗体或CD68单克隆抗体孵育过夜，第2天PBS清洗3遍，使用相应的荧光二抗孵育1 h，PBS清洗3遍后使用带DAPI的封片液封片。荧光显微镜于相同的曝光时间获取照片，每只实验小鼠获取15个视野的图片，使用Image J设定相同的阈值，分别定量CD8+、CD4+阳性细胞总数，CD68阳性细胞的面积。

七、实时荧光定量PCR分析基因表达

Trizol法提取肾皮质总RNA，测量RNA的浓度，每只小鼠转录1 μg总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，使用SYBR试剂盒和下列引物分析基因的表达，GAPDH作为内参。LTN-F: 5′-GCGAATTCAGCAAGACCTCAGCCATGAG-3′; LTN-R5′-CCAAGCTTGAGGCTGTTACCCAGTCAGGGT-3′; Ccl2-F：5′-TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA-3′；Ccl2-R：5′-GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3′；ICAM1-F：5′-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3′；ICAM1-R：5′-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3′；GAPDH-F：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′；GAPDH-R：5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。

八、统计学分析

计量资料采用±sD，均数比较采用方差分析（ANOVA，Bonferroni校正），GraphPad Prism 7软件用于统计分析。P<0.05被认为具有统计学意义。

结果

一、维甲酸可改善NTSN模型小鼠蛋白尿和肾功能

ELISA方法检测小鼠UACR：对照组、NTS组、NTS+维甲酸组UACR的平均值分别为：（0.23±0.07)×10-3 mg/g, (4.52±0.36)×10-3 mg/g、 （2.63±0.18）×10-3mg/g；；NTS组和NTS+维甲酸组比较差异有统计学意义（q=18.45，P<0.01），见图1。

血清尿素氮检测结果示：对照组、NTS组、NTS+维甲酸组BUN均值分别为：(8.90±1.68) mmol/L,（16.81±1.23） mmol/L,（13.33±0.62) mmol/L; NTS组和NTS+维甲酸组比较差异有统计学意义（q=6.155，P<0.01），见图1。

二、维甲酸可改善NTSN模型小鼠肾组织病理改变

 观察肾组织切片所有的肾小球，计数合并有新月体的肾小球数量、节段或球型硬化的肾小球数量，分别除以肾小球总数量，即得到百分比。每组小鼠（n=5）再取平均值进行统计分析。对照组未发现新月体、节段或球性硬化；NTS组合并有新月体的肾小球百分比为：（36±1.58）%；NTS+维甲酸组合并有新月体的肾小球百分比为：（22.2± 1.92）%；两组间差异有统计学意义（q=21.46，P<0.01）。NTS组、NTS+维甲酸组的肾小球硬化率分别为：（18.4±1.14）%、（13.0±1.58）%， 差异有统计学意义（q=10.73，P<0.01），见图2。

三、维甲酸可减轻NTSN模型小鼠CD8+淋巴细胞的浸润

对肾脏冰冻组织切片行CD8+T细胞免疫荧光染色，在200倍的显微镜下获取图片，每只小鼠获取15个视野的图片，使用ImageJ计量CD8+T细胞总数，得到CD8+T细胞均数/每低倍镜视野，每组小鼠（n=5）再取平均值进行统计分析。每低倍镜视野下CD8+T细胞均数：对照组为3.44±0.82个；NTS组为25.72±1.56个；NTS+RA组为17.45±2.85个；NTS组与NTS+维甲酸组差异有统计学意义（q=9.545，P<0.01）见图3。

四、维甲酸可减轻NTSN模型小鼠CD4+淋巴细胞浸润

对肾脏冰冻组织切片行CD4+T细胞免疫荧光染色，在200倍的显微镜下获取图片，每只小鼠获取15个视野的图片，使用ImageJ计量CD8+T细胞总数，得到CD8+T细胞均数/每低倍镜视野，每组小鼠（n=5）再取平均值进行统计分析。每低倍镜视野下CD4+T细胞均数：对照组为(1.23±0.45)个；NTS组为(16.25±1.58)个；NTS+维甲酸组为(9.65±2.20)个；NTS组与NTS+维甲酸组差异有统计学意义（q=8.610，P<0.01），见图4。

五、维甲酸可减轻NTSN小鼠模型单核和（或）巨噬细胞浸润

 对肾脏冰冻组织切片行CD68免疫荧光染色，在400倍的显微镜下获取图片，每只小鼠获取15个视野的图片，使用ImageJ计量CD68阳性细胞面积，得到CD68阳性细胞面积均数/每高倍镜视野，每组小鼠（n=5）再取平均值进行统计分析。每高倍镜视野下CD68细胞面积均数：对照组为(0.03±0.01)pixel2；NTS组为(0.74±0.06) pixel2；NTS+维甲酸组为：(0.42±0.09)pixel2；NTS组与NTS+维甲酸组差异有统计学意义（q=11.08，P<0.01），见图5。

六、维甲酸可抑制NTSN模型小鼠炎症细胞趋化因子的表达

肾皮质相关炎症细胞趋化因子基因表达的定量分析结果提示：NTS组人单核细胞趋化蛋白-1（monocytechemoattractant protein-1，MCP-1) 的表达量较对照组增加约11.3倍，NTS+维甲酸组MCP-1的表达量较对照组增加约6.6倍，NTS组和NTS+维甲酸组差异有统计学意义（q=5.109，P<0.01）。NTS组细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表达量较对照组增加约4.95倍，NTS+维甲酸组ICAM-1的表达量较对照组增加约1.65倍，NTS组和NTS+维甲酸组差异有统计学意义（q=3.581，P<0.05）。NTS组淋巴细胞趋化因子（lymphotactin，LTN)的表达量较对照组增加约27.89倍，NTS+维甲酸组LTN的表达量较对照组增加约17.47倍，NTS组与NTS+维甲酸组差异有统计学意义（q=11.29，P<0.01），见图6。

讨论

ATRA是维甲酸的一代衍生物，是维甲酸体内发挥生物学效应的主要成分，对调节细胞聚集、分化、凋亡、增殖及炎症反应起重要作用。维甲酸在细胞核内的两组受体，即维甲酸受体(retinoic acid receptors，RARs)和维甲酸 X受体(retinoid X receptors，RXRs)普遍存在于各种细胞中，是配体依赖的转录调节子。ATRA主要通过与 RAR高亲和力特异性地结合而发挥生物学效应。当缺乏 ATRA时，RAR／RXR形成异质二聚体，与ATRA调控的靶基因启动区域维甲酸反应元件 (retinoic acid response element，RARE)结合，同时募集阻遏蛋白和组蛋白脱乙酰化酶 (histonedeacetylases，HDAC)至相应DNA区域，HDAC重组蛋白转移乙酰基，改变染色质结构从而对基因转录起到抑制作用。当 ATRA存在时，ATRA与 RAR高亲和力结合，RAR发生构型改变，释放阻遏蛋白，同时募集共激活蛋白如组蛋白乙酰转移酶，激活ATRA调控的靶基因转录及表达，从而发挥对细胞的生物活性调控作用［7］。

维甲酸缺乏或者RAR/RXR敲除可导致小鼠肾脏单位的减少［8］。在抗Thy-1肾炎动物模型中，维甲酸可以通过抑制系膜细胞增殖、减少细胞外基质的沉积、减少单核细胞的浸润从而限制肾脏损害［9］。在嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠模型中，维甲酸处理组有较少的间质单核细胞浸润，纤维连接蛋白表达减少，对单核细胞浸润起关键作用的MCP-1的表达量也减少［10］。在糖尿病肾病的早期模型中，维甲酸可以通过降低肾脏MCP-1和ED-1的蛋白合成，降低蛋白尿水平。体外用维甲酸处理培养的足细胞，可以通过减少单核趋化蛋白的合成从而减少炎症通路的激活［11］。在狼疮性肾炎的小鼠模型中，维甲酸可以减少肾脏趋化因子和细胞因子的表达、减少肾小球IgG沉积、减少蛋白尿、改善肾小球病变［12］。然而维甲酸在新月体肾炎中的作用和机制却不十分清楚。

NTSN模型是以CD8+T细胞浸润为主的新月体肾小球肾炎［13］，巨噬细胞招募在病程中起关键作用，TH1细胞激活亦发挥着重要的作用。我们的研究发现维甲酸可以减轻蛋白尿、改善肾功能、减少新月体的形成，与以往的报道一致［5］。NTSN模型小鼠较对照小鼠CD8+T细胞和巨噬细胞浸润明显增加，符合疾病的自然病程；同时本研究模型维甲酸可以明显减少淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，既往未见维甲酸减少淋巴细胞浸润的报道。

维甲酸可以明显减少CD8+T细胞和巨噬细胞的浸润，表现为肾小球和肾间质的CD8+T细胞和巨噬细胞浸润明显减少。ICAM-1和MCP-1在巨噬细胞招募中起至关重要的作用［14-15］，而我们的研究表明维甲酸可以明显抑制ICAM-1和MCP-1在肾皮质的基因表达水平，ICAM-1和MCP-1的表达减少可能导致了巨噬细胞浸润减少。CD8+T细胞、NK细胞、肥大细胞均能产生 LTN，而CD4+T细胞或单核细胞不表达LTN［13］。LTN特异性的趋化CD8+T 细胞和自然杀伤细胞，本研究发现在NTSN的模型中LTN表达量显著增高，而全反式维甲酸处理可以减少肾脏皮质LTN的表达，浸润的CD8+T细胞减少可能与LTN因子表达减少有关。

激活的TH1细胞可以招募更多的炎症细胞，刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（NO）等损伤调节因子，导致肾小球壁层上皮细胞增殖，促进特征性的新月体形成［4］。本研究的结果提示维甲酸处理可以明显减少肾间质的CD4+淋巴细胞的数量，减少新月体形成，可能与维甲酸抑制一系列炎症因子的表达有关。如Oseto等［16］曾报道在抗肾小球基底膜肾炎模型中，ATRA可以减少肾小球增殖细胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen，PCNA）阳性细胞、ED-1阳性细胞数和α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA) 阳性面积，抑制TNF-α、白介素-1β（IL-1β）、增强子结合蛋白-δ（CCAAT/enhancer binding protein-δ，C/EBPδ)、血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowth factor,PDGF)、转化生长因子-β（TGF-β）、Ⅰ型胶原和α-SMA等基因表达，从而减轻蛋白尿、减少肾脏新月体形成。Rao等［17］发现ATRA处理可以通过增加IkBa活性、抑制核因子-kB（NF-kB） p65活性，从而下调TNF-a 和IL-6的表达，保护肝脏的缺血再灌注损伤。Nozaki等［18］发现ATRA可以减少IL-6、IL-12、TNF-a等细胞因子的表达，减少巨噬细胞的浸润，从而减轻胶原诱导的关节炎小鼠模型的关节损害。在LPS的模型中，维甲酸可以抑制LPS诱导的巨噬细胞产生IL-12，维甲酸诱导的IL-12抑制依赖于NF-kB活性的抑制［19］。这些均说明NF-kB活性的抑制是维甲酸抗炎的可能机制，维甲酸可能通过抑制NF-kB通路，广泛抑制炎症细胞因子的表达。

新月体形成预示着疾病预后差，而炎症细胞浸润在新月体的发展发展中起至关重要作用，我们的研究显示，维甲酸可以减少炎症趋化因子的表达，从而减少炎症细胞的浸润，改善肾功能和肾脏组织学，是临床上治疗新月体肾炎有应用潜力的一个药物。

参考文献（略）

李正东, 方凡, 徐波, 等. 全反式维甲酸对抗肾小球基底膜肾炎小鼠模型肾脏损害的保护作用［J/CD］.中华肾病研究电子杂志,2019，8(3)：114-120.