普通质粒小提试剂盒的应用

背景^[1-6]

普通质粒小提试剂盒采用经典的碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合DNA的特性，可以从1–5ml大肠杆菌LB培养液中快速提取3–20μg纯净的高拷贝质粒DNA。提取的质粒可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等实验。然而，对质粒纯度要求更高的转染实验（要求无内毒素），此试剂盒不能达到要求。另外，尽管该试剂盒可以抽提较大的质粒（>10kb），但不推荐使用。

如果一定要使用，请参考以下方法：加大菌体使用量（使用5–10 ml过夜培养物），同时按照比例增加P1、P2、P3的用量；洗脱缓冲液应在70℃预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率，其它步骤相同。

产品特点

使用了Lysis Dye，菌体裂解是否完全一目了然。由于判断菌体裂解和中和是否彻底更主要取决于操作者的经验，所以我们增加了Lysis Dye（一种能使裂解/中和体系变换颜色的试剂）来帮助观察裂解/中和的程度。加入P1后，Lysis Dye使菌液变为浑浊的红色；加入P2后，Lysis Dye立即使溶液变为澄清的红色，裂解是否完全只要观察红色溶液是否澄清，如果红色非常均一，表明裂解充分；在完全裂解的体系中加入P3混匀后，体系立即变为黄色，任何红色的残留表明没有完全混匀或者中和不彻底。

注意：1.为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入离心吸附柱中，再次离心收集。

2.洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。

3.洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

应用^[7][8]

普通质粒小提试剂盒可用于大肠杆菌利用木聚糖合成木糖醇的研究

木糖醇是一种重要的工业用精细化学品、糖基化学品，具备许多优异特性，广泛用于化工、医药、食品及饲料等行业。传统的木糖醇生产，一般采用酸解法将半纤维素降解为木糖，而后以纯化的木糖为底物，采用化学或生物全细胞催化法将木糖转化为木糖醇，整个制备工艺复杂、安全性差、成本高、环境污染严重，与我国经济发展可持续、可循环、节能减排的工业目标不相符。

针对上述问题以大肠杆菌为宿主，通过对其相关启动子特性的研究，利用合成生物学技术构建新的大肠杆菌，可直接利用木聚糖合成木糖醇，从而为实现清洁生产木糖醇开辟一条新型工艺。研究结果如下：（1）以加强型绿色荧光蛋白（eGFP）为报告基因，对克隆的组成型启动子Ppgi、PgapA、PpykA、PpykF和诱导型启动子PT7进行表征，测得荧光强度依次为102.18、784.12、94.04、163.20和8785.87，组成型启动子中PgapA荧光强度，PT7的荧光强度是PgapA的11.2倍。（2）利用DNA assembler方法，运用PgapA构建木聚糖水解为木糖的途径，得到表达载体pRS42K-xyn-xyl，将其导入原始菌株BL21(DE3)中，获得工程菌株BL21-xyn-xyl，此菌株可成功将木聚糖水解为木糖。（3）采用PT7和PgapA分别构建了转化木糖为木糖醇的表达质粒pET-28a(+)-T7-xr和pET-28a(+)-gapA-xr，导入原始菌株BL21(DE3)后获得工程菌BL21-T7-xr和BL21-gapA-xr。确定了工程菌BL21-T7-xr的IPTG浓度、诱导温度以及初始木糖浓度分别为0.2mM、25℃、10g/L，此时木糖醇的产量为2.92g/L；工程菌BL21-gapA-xr的初始木糖浓度15g/L，此时木糖醇的产量为8.48g/L。比较条件下两株工程菌的木糖醇生产情况，发现菌株BL21-gapA-xr的木糖醇产量更高，说明组成型启动子PgapA更加有利于木糖醇的生产。进一步确定了工程菌BL21-gapA-xr的木糖补料浓度为8g/L，此时木糖醇产量达到最高为40.6g/L。（4）将表达质粒pRS42K-xyn-xyl和pET-28a(+)-gapA-xr同时导入敲除木糖异构酶基因的工程菌株BL21-T中，得到集成菌株BL21-xyn-xyl-xr-T。

参考文献

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[2]Production of xylitol from d-xylose and glucose with recombinant Corynebacterium glutamicum[J].So-Hyun Kim,Ji-Yeong Yun,Sung-Gun Kim,Jin-Ho Seo,Jin-Byung Park.Enzyme and Microbial Technology.2009(5)

[3]Proteome‐based identification of fusion partner for high‐level extracellular production of recombinant proteins in Escherichia coli[J].Zhi‐GangQian,Xiao‐XiaXia,Jong HyunChoi,Sang YupLee.Biotechnol.Bioeng..2008(3)

[4]Insights from modeling the 3D structure of NAD(P)H-dependent d-xylose reductase of Pichia stipitis and its binding interactions with NAD and NADP[J].Jing-Fang Wang,Dong-Qing Wei,Ying Lin,Yong-Hua Wang,Hong-Li Du,Yi-Xve Li,Kuo-Chen Chou.Biochemical and Biophysical Research Communications.2007(2)

[5]Engineering Escherichia coli for xylitol production from glucose‐xylose mixtures[J].Patrick C.Cirino,Jonathan W.Chin,Lonnie O.Ingram.Biotechnol.Bioeng..2006(6)

[6]Effect of pretreatment severity on xylan solubility and enzymatic breakdown of the remaining cellulose from wheat straw[J].Mirjam A.Kabel,Gijs Bos,Jan Zeevalking,Alphons G.J.Voragen,Henk A.Schols.Bioresource Technology.2006(10)

[7]Microbial xylitol production from corn cobs using Candida magnoliae[J].Kiyoshi Tada,Jun-Ichi Horiuchi,Tohru Kanno,Masayoshi Kobayashi.Journal of Bioscience and Bioengineering.2004(3)

[8]王翠薇.大肠杆菌利用木聚糖合成木糖醇的研究[D].石河子大学,2013.