胰蛋白酶抑制剂的生物功能

背景及概述[1-2]

胰蛋白酶抑制剂是抑制胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可能是外源性或内源性化合物。包括：α-抗胰蛋白酶、抑蛋白酶多肽、卵黏蛋白、BowmarrBirk大豆胰蛋白酶抑制物、Kazal胰腺胰蛋白酶抑制物、Kunitz大豆胰蛋白酶抑制物等。胰蛋白酶(Trypsin)在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。其在胰脏以酶的前体——胰蛋白酶原被合成的。胰蛋白酶原受肠激酶或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。其不仅起消化酶的作用，而且能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶抑制剂(Trypsininhibitor，TI)普遍存在于自然界的动物、植物和微生物中，目前，研究较多的胰蛋白酶抑制剂主要来源于人类主要的粮食，如豆科、乔本科，在十字花科中也有报道。而在动物界中，动物的血液、胰脏，以及酵母菌、链霉菌属等微生物中亦有胰蛋白酶抑制剂的存在。

分类及结构[2]

胰蛋白酶抑制剂可以与胰腺分泌的丝氨酸蛋白酶系(如胰蛋白酶、糜蛋白酶等)发生不可逆的反应。胰蛋白酶抑制剂与其靶酶的相互作用，通常与酶和底物之间的相互作用一样，属于互补型作用机制。胰蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶(或糜蛋白酶)相互反应时，抑制剂暴露在外的活性中心(反应位点)与靶酶的活性中心通过氢键相连，形成稳定的复合物，从而导致酶活性中心的闭锁，使靶酶的活性丧失，且此反应是不可逆的。与通常的酶催化反应相比，胰蛋白酶与其抑制剂之间反应的米氏常数(Km)很低，故胰蛋白酶与其抑制剂的亲和力大，两者可以迅速结合成无活性、不可逆的复合物。与一般的酶的底物不同，酶对抑制剂的反应位点的肽键并不能作用，抑制剂与酶结合后其活性中心的肽键并不裂解或裂解速率极慢。因此，该复合物虽然可以分解成游离的酶和变性或未变性的抑制剂，但解离速率非常缓慢。

结构[2]

胰蛋白酶抑制剂根据分子质量、半胱氨酸含量、反应位点的数量主要可分为Kunitz型抑制剂、Bowman-Birk型抑制剂、PotatoⅠ型、PotatoⅡ型及Kazal型。其中研究最为广泛和深入的是Kunitz型抑制剂及Bowman-Birk型抑制剂两类，分别是库尼兹胰蛋白抑制剂(KunitztypeTrypsininhibitor，简称KTI)和鲍曼-贝尔克胰蛋白酶抑制剂(Bowman-BirktypeTrypsininhibitor，简称BBTI)。1947年首次自大豆中分离和结晶出Kunitz胰蛋白酶抑制剂，发现其分子质量约20.1kD，其半胱氨酸含量相对低，分子内含有2个二硫键和1个反应位点，该反应位点一般只能与胰蛋白酶相互作用。大豆中的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂，分子内含有181个氨基酸残基，2个二硫键(Cys39～Cys86、Cys138～Cys145)，分子中多以松散的线团状的分子存在，位于138位和145位的半胱氨酸之间形成了二硫键，结合形成了一个由8氨

基酸组成的小环，另外在39位和86位的半胱氨酸之间形成了第2个二硫键。其活性中心位于第63位的精氨酸和第64位的异亮氨酸，这2个氨基酸位于分子的外部，并且一个KTI分子抑制剂能钝化1个分子胰蛋白酶。其他来源的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂也被陆续研究。而来自牛的胰腺的胰蛋白酶抑制剂也属于Kunitz型，其分子质量为6.5kD，含有3个二硫键，但同样只有1个反应位点。利用晶体学和圆二色性方法研究大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的蛋白结构主要由β折叠组成，同时由12组反向平行的β-股以疏水侧链、随机卷曲和转角结构稳定形成的十字交叉的区域。Kunitz型胰蛋白酶抑制剂已经从刺桐(Erythrina)、四棱豆、牧豆树、葵花籽、洋紫荆(Bauhinavariegata)、凤凰木(Delonixregia)、猪屎豆(Crotalariapaulina)、黎豆(Mucunapruriens)、海红豆(Adenantherapavonina)、棕色腰豆等植物的种子及土豆等提取获得。Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(BBTI)于1946年由自大豆中分离获得。该Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂的分子质量大约为8kD，富含半胱氨酸，包含2个反应位点及7个二硫键。2个反应位点分别抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反应位点的单边结构呈现环状结构。一环状结构为胰蛋白酶结合区域含有4个二硫键，可抑制胰蛋白酶的活性，而另一环状结构为胰凝乳蛋白酶的结合区，存在3个二硫键，可与胰凝乳蛋白酶相结合抑制其活性。由于分子内富含二硫键和亚基间的极性相互作用，这些BBTI的热稳定性和酸碱稳定性较好。目前已从多种来源中分离纯化得到BBTI。自中国竹臭蛙的皮肤分泌物中提取获得只有62个氨基酸的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂。自蚕豆中，利用色谱法分离了分子质量为7.5kD的Bowman-Birk型抑制剂，其具有抗菌作用，可抑制HIV-1反转录酶活性，同时对鼠的脾细胞具有促进增殖的作用。

PI-Ⅰ和PI-Ⅱ家族是一类诱导型的蛋白酶抑制剂。其中PI-Ⅰ家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅰ和番茄蛋白酶抑制剂Ⅰ，它们的分子质量为8.1kD，只有1个活性中心，主要抑制胰蛋白酶，而对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱。PI-Ⅱ家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ和番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ，由2个重复序列构成，分子质量为24kD，包含2个活性中心，能抑制胰蛋白酶和凝乳蛋白酶。 

生物功能[2]

胰蛋白酶抑制可以与生物的胰蛋白酶结合，不可逆形成无酶活性的复合物，从而抑制了生物对蛋白质的消化、吸收和利用等能力，也因此被称为抗营养因子。而昆虫摄入蛋白酶抑制剂后，其与昆虫肠道的蛋白酶形成稳定的复合物，从而使昆虫的蛋白消化酶活性受到抑制。同时，蛋白酶和蛋白酶抑制剂的复合物还可能作为一个负反馈信号抑制昆虫的进食。这种重效应将降低害虫对食物蛋白的有效利用率同时也减少了食物的摄取，最终导致昆虫由于缺乏必需的营养(蛋白质)停止发育并最终死亡。抗虫害是胰蛋白酶抑制剂的生物功能。胰蛋白酶抑制剂的生理作用除了抗微生物、抗虫害外，其对生物的生长发育，甚至细胞的凋亡也都有调节作用。而近些年来人们也注意到了胰蛋白酶抑制剂的抗病毒和抗癌作用，并广泛开展了这方面的相关研究。在抗病毒方面，豆类中提取了Kunitz型胰蛋白酶抑制剂，该抑制剂可以抑制对HIV-1增殖至关重要的HIV-1反转录酶的活性，从而使得此胰蛋白酶抑制剂具有了抑制HIV-1增殖的可能性。Ye等[18]发现来自蚕豆的Bowman-Birk型抑制剂也同样具有抑制HIV-1反转录酶活性的作用。这些研究都说明胰蛋白酶抑制及具有抑制病毒增殖的可能性。

在抗肿瘤方面，自北海道黑豆中提取的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂显示了对MCF-7乳房癌细胞增殖的抑制作用，此研究也表明了该胰蛋白酶抑制剂可能具有抗癌的作用。自大豆中提取的胰蛋白酶抑制剂通过下调uPA尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物从而阻止卵巢癌细胞的扩散，该研究同样证实了胰蛋白酶抑制剂可能存在抗癌的生理活性。自蚕豆中提取、分离获得了分子质量为15kD的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂，除了可以抑制HIV-1的反转录酶的活性外，同时具有通过诱导染色质凝聚和细胞凋亡而抑制HepG2肝肿瘤细胞增殖的能力。自宫粉羊蹄甲提取的一种新型的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(BvvTI)，除了具有抑制HIV-1的反转录酶的活性外，还可明显地抑制鼻咽癌细胞CNE-1增殖作用，同时对细胞活素类和细胞凋亡都有影响。胰蛋白酶抑制剂的这些生物活性赋予了应用于医药的潜力。但关于胰蛋白酶的抑制剂对肿瘤细胞和HIV-1的逆转录酶的抑制机制到目前为止还未明确，需要进一步的研究探讨。

提取及纯化方法[3]

1.    从动物脏器中提取

牛肺胰蛋白酶抑制剂(也称抑肽酶)的分子质量为6.2×103u，是由58个氨基酸残基组成的碱性多肽.它的一级结构和二级结构均已阐明，分子内有3对二硫键，整个分子呈梨型，活性中心为赖氨酸，位于分子的顶端.从分子质量看有两类，一类是分子质量较大的；一类是分子质量较小的.将化学改性与修饰壳聚糖体，共价偶联配基牛胰蛋白酶，制成固定化酶为抑肽酶亲和吸附剂，直接对黄牛肺提取液一步层析纯化，再超滤脱盐、浓缩、去热原，冻干即抑肽酶.抑肽酶比活5.7×10

3kIU/mg，收率22×104kIU/kg(牛肺)；固定化酶单位活力2.595×103kIU/g(干)，酶活性回收率55%，非特异性吸附较小，机械强度高，可反复使用.

2.    从人尿中提取

人尿胰蛋白酶抑制剂(HUTI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，表观分子质量为67×103u，等电点为2～3.它是一种糖蛋白，糖的质量分数高达20%～30%.人尿中的抑肽酶不同于由牛肺、胰提取的抑酶，它对人体不产生抗原抗体反应，更适于临床.目前提取UTI的方法有综合使用三氯醋酸、硫酸铵、甲醇沉淀法，使用膨润土法，使用DEAE-纤维素法，使用固定化胰蛋白酶的方法，直至最近使用的脱乙酞壳多糖以及硅酸镁的方法.利用纯胰蛋白酶作为配体偶联于CNBr-Sepharose4B为亲和载体，在不同条件下洗脱亲和蛋白，可从粗品溶液中快速分离纯化具有胰蛋白酶抑制活性的两种纯产物.根据洗脱条件，可将有抑制活性的20×103和40×103u蛋白质分离为两个单独组分或混合物.其中20×103u组分的抑制活性回收率为35%，抑制比活为3.387×103kIU/mg；40×103u组分的相应值分别为53%和3.116×103kIU/mg.混合物的抑制活性回收率和抑制比活分别为89%和3.076×103kIU/mg.

3.    植物中提取

20世纪40年代人们发现植物中含有蛋白酶抑制剂，在植物贮藏器官，特别在种子中，其含量常常高达总蛋白的10%.食物中植物胰蛋白酶如果没被除去或抑制，它在体内能与小肠液中胰蛋白酶、糜蛋白酶结合，生成无活性复合物，消耗和降解胰蛋白酶，导致肠道对蛋白质消化、吸收及利用能力下降.导致胰腺肿大和体内氨基酸代谢失调等疾病.但也有报导大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗、调节胰岛素失调有一定效果.利用固定化胰蛋白酶分离纯化大豆胰蛋白酶抑制剂可得到高纯度的大豆胰蛋白酶抑制剂.研究结果表明：大豆胰蛋白酶抑制剂通过各阶段纯化后其活性从0.95kIU/mL增高至325.5kIU/mL，纯化程度提高324.6倍，得率0.033%；电泳结果表明：利用固定化胰蛋白酶分离纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂有单谱带，纯化效果明显.从已发表的Ti基因顺序设计了引物，通过PCR技术从大豆总DNA中扩增了Tid基因的编码序列，从而最终获得了Ti蛋白一级结构的资料.采用凝胶层析及离子交换层析等方法，从苦荞种子中分离出一组胰蛋白酶抑制剂(TBTIⅠ、Ⅱ).对其性质研究表明：两个组分均对胰蛋白酶有较强的抑制作用，对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱，其中TBTI-Ⅱ的抑制作用大于TBTI-Ⅰ，两者对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和SephadexG-100凝胶层析分别对纯化产物进行分析得出TBTI-Ⅰ和TBTI-Ⅱ的近似分子质量分别为15.0×103u和18.0×103u.TBTI-Ⅰ、Ⅱ都具有较高的热稳定性，在100℃处理10min后可保留86%左右的抑制活性.TBTI在酸性环境下较为稳定，在pH2.0条件下保温1h，仍保留75%的抑制活性.用Lineveaer-Burk作图法得知，该抑制剂属竞争性抑制类型，TBTI-Ⅱ的Ki值为3.59×10-7mol/L(以BAPNA为底物)，对胰蛋白酶的摩尔抑制比为1∶1.4.以菠菜种子为材料，经脱脂、酸性溶液抽提、热变性、硫酸铵分部沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物，再经离子交换、亲和层析和凝胶过滤，分离得到胰蛋白酶抑制剂SOTI，纯化倍数为57.22，SDS-PAGE测定其分子质量约为22×103u，等电聚焦测定其等电点为4.02.SOTI具有较高的热稳定性，在100℃处理后仍然具有一定的抑制活性.

主要参考资料

[1] 营养科学词典

[2] 胰蛋白酶抑制剂的结构与功能研究进展

[3] 胰蛋白酶抑制剂的研究进展