血竭素高氯酸盐的应用

概述^[1]

血竭为棕榈科植物麒麟竭果实及树干中的树脂。此外，龙舌兰科植物龙血树(Dracaenaombetkatschy)的树脂也作为血竭用。其主要成分有血竭素、血竭红素等。实验研究表明，血竭有抗炎止痛、抗真菌及抗血栓等药理作用。血竭素高氯酸盐(dracorhodinperchlorate)已人工合成，其药理及毒理研究报道较少。

应用^[1-2]

血竭素高氯酸盐诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡。MTT法测定血竭素高氯酸盐对HeLa细胞的细胞毒作用。通过显微镜，荧光染色观察细胞形态学变化，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA片断化。用Western印迹法分析药物对蛋白质表达的影响。结果　血竭素高氯酸盐明显抑制HeLa等细胞的增殖，诱导HeLa细胞调亡。Caspase1，3，8，9及家族抑制剂可明显抑制血竭素高氯酸盐诱导的凋亡。Western印迹结果显示血竭素高氯酸盐作用12h后Bax及BclXL的表达明显改变，caspase3，8前体及caspase3底物ICAD和PARP发生降解。结论　血竭素高氯酸盐(60μmol·L-1)通过改变Bax/BclXL的表达激活caspase途径诱导HeLa细胞凋亡。

血竭素高氯酸盐促进瘢痕成纤维细胞凋亡的作用。应用四甲基偶氮唑(MTT)法、特异性荧光染色和原位末端标记技术(TUNEL)分别检测血竭素高氯酸盐对成纤维细胞的抑制率和凋亡指数。结果MTT法显示血竭素高氯酸盐对成纤维细胞的抑制率增高，且呈现浓度和时间依赖性(P<0.05)。特异性荧光染色和TUNEL法检测凋亡指数，均呈剂量依赖性增高(P<0.05)。结论血竭素高氯酸盐对瘢痕成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用，且呈量效关系促进成纤维细胞发生凋亡。

制备^[3]

血竭素高氯酸盐制备如下：

步骤1)：制备化合物Ⅰ(2，4，6-三甲氧基苯甲醛)

将化合物SM(间苯三酚三甲醚)100g和DMF500ml混合，冰盐浴降温至0℃以下，滴加201g(2.2eq)三氯氧磷，控温0℃以下，加毕，在0℃以下保温反应1h，TLC跟踪反应完成；将反应液倒入冰水中，用碳酸钾溶液调至弱碱性(pH为8-10)，析晶过夜，抽滤得白色固体，干燥得101g产品(化合物Ⅰ)，其氢核磁共振(HNMR)谱图见图1。

步骤2)：制备化合物Ⅱ(1，3，5-三甲氧基甲苯)

将化合物Ⅰ的产品80g溶于乙二醇500ml，加入85％水合肼4eq.，80℃反应3h，基本溶解，TLC跟踪原料消失，然后，向反应液中加入氢氧化钾4eq，升温至120℃回流反应，反应3h，TLC跟踪反应完成，降温至10-25℃，倒入冰水中，抽滤，水洗，得75g产品(化合物Ⅱ)。

第3)步：制备化合物Ⅲ(3-甲基-2，4，6-三甲氧基苯甲醛)

将式化合物Ⅱ的产品50g溶于DMF中200ml，冰盐浴降温至0℃以下，滴加2.2eq.三氯氧磷，控温0℃以下，加毕，室温下反应，TLC跟踪反应完成；将反应产物倒入冰水中，碳酸钾溶液调至弱碱性(pH为8-10)，析晶过夜，抽滤得白色固体，干燥，得45g产品(化合物Ⅲ)，其氢核磁共振(HNMR)谱图见图2。

步骤4)：制备化合物Ⅳ(3-甲基-2，4，6-三羟基苯甲醛)

将化合物Ⅲ的产品40g溶于二氯甲烷200ml，在氮气保护下，降温至-78℃以下，滴加三溴化硼6eq，控温-78℃以下，加毕，自然升温至室温反应过夜(约12-24小时)，TLC跟踪反应完成；将反应产物倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，浓缩得30g化合物Ⅳ的粗品，直接用于下一步反应。

第5)步：制备化合物Ⅴ(2-羟基-3-甲基-4，6-二苄氧基苯甲醛)

将化合物Ⅳ的产品20g溶于丙酮40ml，加入碳酸钾3.5eq.，冰水浴降温，滴加溴苄2.2eq，加毕，50-60℃左右反应过夜，TLC跟踪反应；将反应物倒入水中，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，浓缩得30g化合物Ⅴ的粗品。柱层析纯化，得产品15g，鉴定为一个在苯环羟基上引入苄基的中间体，其氢核磁共振(HNMR)谱图见图3。

步骤6)：制备化合物Ⅵ(2-甲氧基-3-甲基-4，6-二苄氧基苯甲醛)

将化合物Ⅴ的产品15g溶于DMF50ml中，加入碳酸二甲酯200ml和DBU1.2eq.，加毕回流过夜(约12-24小时)；次日TLC跟踪，反应完毕，降至室温，有固体析出，加入500ml水，搅拌30min，乙酸乙酯萃取分液，旋干，得10g化合物Ⅵ的产品，鉴定为一个在苯环羟基上引入甲基的中间体。

步骤7)：制备化合物Ⅶ(2-甲氧基-3-甲基-4，6-二羟基苯甲醛)

将式化合物Ⅵ的产品8g加入到乙酸乙酯50ml中，加入甲醇100ml溶解，加入钯碳0.8g，氮气置换，氢气置换(氢气压力1-5atm)，室温反应过夜(约12小时)，TLC跟踪，原料消失；将反应产物抽滤，乙酸乙酯淋洗，旋干得产品。回锅反应(操作同前)，TLC跟踪反应完成。抽滤，乙酸乙酯淋洗，旋干得4g。

步骤8)：制备化合物Ⅹ(即血竭素)

将化合物Ⅷ的产品4g溶于甲醇中，向其中滴加饱和醋酸钠水溶液50mL，放置，析晶，得到血竭素。

步骤9）血竭素高氯酸盐的制备方法

将化合物Ⅷ的产品5g用60ml甲醇溶解，滴加高氯酸2ml的甲醇溶液80ml，搅拌反应2h。析出橙红色晶体，过滤，固体用甲醇重结晶，得血竭素高氯酸盐纯品5g，氢核磁谱图化学位移数据为：(MeOD，300M)，2.396，Me，3H；4.094，MeO，3H；7.391，ArH，1H；7.731-7.858，ArH，3H；8.414-8.469，ArH，3H；9.311-9.340，1H。

主要参考资料

[1] 血竭素高氯酸盐诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的机制

[2] 血竭素高氯酸盐促进瘢痕成纤维细胞凋亡的作用

[3] CN201610059078.X血竭素及其盐、中间体的制备方法以及这些中间体化合物

[4] CN201610059078.X血竭素及其盐、中间体的制备方法以及这些中间体化合物