越橘花青素的主要应用

背景及概述^[1]

花青素作为一类广泛存在于植物中的水溶性色素，具有类黄酮的典型结构，是一种天然抗氧化剂，具有抗衰老、清除自由基、抗炎、调节血脂、抗癌、改善视力等多种功能。与合成色素比较，天然色素安全性较高，对人体的危害相对较小，欧洲将花青素含量≥24％的色素提取物作为药用，其中欧洲越橘花青素的提取物已被意大利、德国等国家的药典收载。近年来研究陆续证明花青素具有一系列生理保健功效，笃斯越橘作为果蔬中含抗氧化成分最丰富的一种资源，抗氧化能力很强，并具有促进视红素再合成、抗炎抗菌、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老和抑制癌症细胞发生等药理学功效。由于笃斯越橘在所有果蔬中花青素含量最高，且我国的笃斯越橘种植产业发展迅速，以笃斯越橘为原料生产越橘花青素具有较好的资源优势。目前关于笃斯越橘花青素的研究主要涉及提取纯化工艺技术以及稳定性试验方面，绝大多数试验以笃斯越橘鲜果为实验对象，而笃斯越橘作为季节性水果且不易保存，不利于工业大规模生产。

性状

制备^[1-2]

方法1：越橘花青素制备如下：取笃斯越橘冻干粉，精密称定，放置于100毫升棕色容量瓶中，加入一定体积和确定pH值的乙醇溶液，置于预先设定好的水浴温度下浸提一段时间。提取结束后，将提取液倒入离心管中，置于冷冻离心机中以4000转/min离心10min。取上清液10ml，用2％盐酸－甲醇稀释至适量，于80℃水浴30min，冷却。用2％盐酸－甲醇稀释至刻度，摇匀，取5 ml于25 ml容量瓶中，用2％盐酸－甲醇稀释至刻度，摇匀，即得越橘花青素。

方法2：一种从越橘中制备越橘花青素的工业化方法。本发明先采用酸性水溶液在抗氧化剂茶多酚的存在下进行提取，再利用絮凝剂在酸性的条件下进行除杂，然后利用弱极性大孔吸附树脂进行分离纯化获得高纯度的花青素产品。它包括以下步骤：

(1)提取：将越橘果实用pH值为2～4的酸性水溶液在茶多酚为抗氧化剂的条件下进行提取，得到含有花青素的提取液；

(2)除杂：向提取液中加入一定量的絮凝剂，在一定条件下搅拌均匀后静置，然后通过过滤和离心去除其中的固形物杂质，得到溶液；

(3)纯化：将溶液先用弱极性的大孔吸附树脂进行吸附，然后用乙醇溶液对大孔吸附树脂进行解析，得到含有花青素的乙醇溶液；

(4)浓缩：将乙醇溶液进行减压浓缩，得到浓缩液；

(5)干燥：浓缩液采用喷雾干燥，得到越橘花青素产品。

应用^[3-4]

花青素是一种水溶性色素，可以随着细胞液的酸碱改变颜色。细胞液呈酸性则偏红，细胞液呈碱性则偏蓝，花青素是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。花青素为植物二级代谢产物，在生理上扮演重要的角色，花青素是纯天然的抗衰老的营养补充剂，研究证明是当今人类发现最有效的植物抗氧化剂，它的抗氧化性能比维生素E高出五十倍，比维生素C高出二十倍。它对人体的生物有效性是100％，服用后二十分钟就能在血液中检测到，对增强视力、消除眼睛疲劳、延缓脑神经衰老有显著的功效，同时对由糖尿病引起的毛细血管病也有较好治疗作用，还能增强心肺功能、预防老年痴呆等多种疾病。

1）越橘花青素提取物对3T3-L1前脂肪细胞生长抑制作用。采用MTT法观察细胞生长抑制并确定半数抑制浓度(IC50)，LDH(lactatedehydrogenase)法评价提取物引起的细胞膜损伤，流式细胞计法测定细胞周期，荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学特征。结果：笃斯越橘花青素提取物能够有效地抑制3T3-L1前脂肪细胞的生长且IC50约为214μg/mL；LDH实验表明细胞LDH释放率在24、48、72h分别为89.0%、85.2%、67.8%，72h时相对24h或48h明显降低(P<0.05)，提取物对3T3-L1前脂肪细胞膜的通透性未见明显增加；笃斯越橘花青素提取物能够有效诱导细胞凋亡，同时在S或G0/G1期产生阻滞，但是对细胞的G2/M期未见明显影响，荧光显微镜观察细胞出现典型凋亡特征。笃斯越橘花青素提取物能有效抑制3T3-L1前脂肪细胞生长的作用，具有开发为天然抗肥胖功能因子的潜在可能。

2）越橘花青素对人胚胎巩膜成纤维细胞（Humanfetalscleralfibroblast，HFSF）表达MMP-2、CollagenI蛋白的影响。对HFSF细胞进行复苏培养，在倒置相差显微镜下观察其细胞生物学特性；分别用0、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1mg/mL越橘花青素作用于HFSF细胞达6h、8h、12h、24h、48h，MTT法检测越橘花青素对HFSF细胞增殖的影响；用浓度为0，10-1mg/mL的越橘花青素作用于HFSF细胞达12h，流式细胞仪检测越橘花青素对HFSF细胞周期和细胞凋亡的影响；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测越橘花青素对HFSF细胞表达MMP2、COL1A1、COL1A2基因的影响；免疫印迹法（WesternBlot）检测越橘花青素对HFSF细胞表达基质金属蛋白酶2（Matrixmetalloproteinase2，MMP-2）、I型胶原蛋白（CollagenI）的影响；免疫印迹法（WesternBlot）检测TGF-β2对HFSF细胞表达I型胶原蛋白（CollagenI）的影响。结果体外培养的成熟人胚胎巩膜成纤维细胞多呈梭形，束状或旋涡状排列；MTT结果显示越橘花青素促进HFSF细胞生长，在浓度10-1mg/mL、培养12h时细胞的增殖率最高；流式细胞术的结果显示越橘花青素的作用增加了G2期的HFSF细胞，且对HFSF细胞凋亡没有影响；qRT-PCR检测的结果显示越橘花青素作用HFSF细胞后，下调其MMP2基因的表达量，而细胞COL1A1、COL1A2基因表达量的改变没有统计学意义；WesternBlot检测的结果显示越橘花青素作用HFSF细胞后，下调其MMP-2蛋白的表达，而细胞CollagenI蛋白的表达未检测出；使用TGF-β2作用HFSF细胞后，WesternBlot法能够检测到细胞CollagenI蛋白的表达。结论：越橘花青素促进体外培养HFSF细胞的生长，并具有抑制MMP-2蛋白表达的作用。TGF-β2能够诱导HFSF细胞表达CollagenI蛋白。

主要参考资料

[1] 响应曲面法优化笃斯越橘花青素提取工艺

[2] 笃斯越橘花青素提取物对3T3-L1前脂肪细胞生长的抑制作用

[3] 越橘花青素对人巩膜成纤维细胞表达MMP-2、CollagenⅠ蛋白的影响