DPN I甲基化模板消化酶的应用

背景^[1-6]

DPN I甲基化模板消化酶可有效识别并切断腺嘌呤甲基化的GmATC，而不能切断非甲基化的GATC序列。从（dam+）菌株中提取的质粒因已经被甲基化，可作为Dpn I的底物。该产品可广泛应用于分子克隆、基因分型、DNA印迹、RFLP技术、SNP等多项技术领域。酶切位点：5'GAm6↓TC 3'、3'CT↑Am6G 5'。原核细胞为了保护自己，选择性地降解外源DNA，可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。限制内切酶负责降解进入原核细胞的外源DNA，甲基化酶则对细胞自身的DNA进行甲基化，从而保护细胞的DNA，使其不被自己细胞内的限制性核酸内切酶降解。

除了上述限制性修饰系统，DNA甲基化在调节基因组复制，错配修复和促进/抑制蛋白表达过程中发挥作用。参与这些过程的甲基化酶（如Dam和Dcm甲基化酶）与限制性修饰系统是独立的，但仍然可以影响某些限制性内切酶是否能有效地切开DNA。尽管不是所有的原核DNA有着相同的甲基化水平，但是在酶切消化的时候还是要考虑甲基化的影响。尽管有些甲基化酶不属于限制性修饰系统，但是他们识别的序列和有些内切酶的识别位点重合，从而抑制了这些酶的酶切功能。

比如XbaI的识别序列是TCTAGA，如果在该序列前面有GA紧邻或者该序列后面有TC接着，那么Dam的甲基化作用会使得XbaI切不开该位点。相反地，DpnI酶切要发挥活性则需要DNA发生甲基化。DpnI酶在定点突变中是一个很常用的酶，它一般用于老的DNA模板的去除。而这些老的DNA模板需要从dam+的大肠杆菌中提取才行，这样提取的DNA质粒上的GATC序列会带上甲基化修饰，刚好可以被DpnI酶给消化掉。而通过PCR扩增出来的新的DNA模板则会被保留。

应用^[7][8]

DPN I甲基化模板消化酶可用于蛋白激酶CDK8丝氨酸乙酰化及其功能的研究

通过本次试验确认蛋白激酶CDK8丝氨酸位点存在乙酰化修饰,并且进一步探讨蛋白激酶CDK8丝氨酸乙酰化修饰对其磷酸化下游底物CTD结构域的影响。方法：

1.根据Open Resarch结果,确认真核细胞中内源性蛋白激酶CDK8丝氨酸位点的乙酰化：提取293T细胞总蛋白,IP纯化内源性CDK8,通过液-质连用质谱技术(LC-MS/MS)检测所有氨基酸位点乙酰化修饰位点,了解蛋白激酶CDK8丝氨酸乙酰化修饰在功能区的分布状态及比例。

2.检测外源性蛋白激酶CDK8在原核细菌中的丝氨酸的乙酰化修饰：构建PQE30-His-CDK8重组质粒,通过IPTG诱导剂使外源性CDK8质粒在原核细菌BL21中表达,Ni柱纯化外源性CDK8,LC-MS/MS技术检测该蛋白丝氨酸乙酰化修饰情况。

3.检测外源性蛋白激酶CDK8在真核细胞中的丝氨酸的乙酰化修饰：构建PCDNA3.0-Flag-CDK8重组质粒,通过转染技术把质粒导入293T细胞进行表达,免疫沉淀技术纯化外源性CDK8,LC-MS/MS技术检测该蛋白丝氨酸乙酰化修饰。

4.检测蛋白激酶CDK8的丝氨酸乙酰化修饰对其磷酸化功能的影响：①构建PCDNA3.0-Flag-CDK8突变质粒[突变位点是把蛋白激酶CDK810、11位上的丝氨酸分别突变成丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C),通过转染把质粒导入293T细胞表达,免疫沉淀技术纯化外源性CDK8。②构建PQE30-His-CTD质粒,将表达的CTD蛋白与突变的蛋白激酶CDK837℃孵育一小时,LC-MS/MS技术检测CTD蛋白的磷酸化修饰情况。鉴定蛋白激酶CDK8激酶10、11位丝氨酸乙酰化修饰对蛋白激酶CDK8激酶磷酸化功能的影响。

结论1.证实了真核细胞或原核细菌中蛋白激酶CDK8丝氨酸都广泛存在乙酰化修。许多乙酰化修饰位点已被证实可以发生磷酸化修饰,这揭示了丝氨酸位点的乙酰化和磷酸化修饰可能存在竞争关系。2.CDK8第10、11位丝氨酸乙酰化和磷酸化修饰的动态平衡会影响该蛋白对下游底物CTD结构域的磷酸化功能。

参考文献

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[8]王道光.蛋白激酶CDK8丝氨酸乙酰化及其功能的研究[D].山东大学,2015.