植物组织直接PCR试剂盒的应用

背景^[1-6]

植物组织直接PCR试剂盒利用该试剂盒可以在15分钟内开始从叶子（或其他植物组织）进行基因组DNA的PCR。该方法不需要用液氮对植物组织进行冰冻、机械处理、纯化或者DNA的沉淀。该试剂盒也可以对提取的基因组DNA进行PCR扩增。PCR试剂含有染料，可以直接在电泳胶上样。

0.5到0.7cm的植物叶片与提取液在95度孵育10分钟提取基因组DNA。加入同样体积的稀释液中和。然后可以取部分提取物进行PCR扩增。植物组织直接PCR试剂盒采用独特的溶液系统可以快速从植物叶片，种子等样品中提取微量基因组DNA，可以在15-20min内完成基因组DNA提取，提取的DNA可以马上用于PCR反应，完全不需要其他去蛋白，RNA或者次生代谢产物的过程，足够满足快速检测的需要，因此特别适合大规模基因检测。

只需要微量的样品（5mg左右）就能得到可以用于100次左右的PCR反应模板，节约用户宝贵的实验材料，整个过程不需要有机溶剂抽提等步骤，节省您宝贵的实验时间，而且试剂中不含有毒物质，免去实验人员接触有毒试剂的危险。使用本试剂盒提取的基因组DNA可以直接用于PCR扩增实验，或者于4°C保存备用。本试剂盒中提供的2×Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。

注意事项

1.试剂盒只适合于多糖多酚含量低的植物叶片样本，如小麦、水稻、烟草、玉米、大豆、油菜等。不适合多糖多酚含量高的植物样本。

2.建议使用新鲜采取的叶片组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜，若为成熟的叶片，避免使用叶片主脉部位组织。

3.电泳检测时，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则，电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。

4.建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率。

应用^[7][8]

用于水稻黄绿叶基因YGL8和YGL9的克隆与功能分析

水稻(Oryza sativa L.)是世界上极其重要的粮食作物之一,同时也是单子叶植物研究的重要模式植物。水稻主要通过叶片中的叶绿体进行光合作用,合成碳水化合物并将其贮藏于稻谷中。叶色突变是植物中普遍存在的一种现象,一般来说,叶色突变体都涉及到光合色素含量的变化,因而直接体现在叶片颜色的变化上。光合色素的主要功能就是吸收光能和传递电子,因此,其在光合生物的光合过程中扮演着关键角色。大量的研究结果显示,叶色突变体是研究植物光合色素代谢、叶绿体结构功能、叶绿体发育、光合作用以及光形态建成的理想材料。本研究利用了经EMS(ethyl methane sulfonate)诱变籼稻恢复系缙恢10所产生的两个黄绿叶突变体,克隆了两个水稻黄绿叶基因YGL8和YGL9,并对其进行了功能互补验证,同时,对这两个基因的器官特性表达情况以及相关基因的表达情况进行了分析,也对这两个基因所编码的蛋白的结构和功能等进行了分析。

克隆了包含LOC_Os03g03990在内的6812 bp野生型基因组序列(包括4373bp的编码区上游序列、1167 bp的编码区序列和1272 bp的编码区下游序列)构建功能互补载体并转化ygl9突变体愈伤组织,阳性转化植株的叶片全部恢复了正常绿色且其叶绿素和类胡萝卜素含量也达到野生型水平。这些结果证明,LOC_Os03g03990基因就是YGL9基因。YGL9蛋白结构分析系统进化树显示,YGL9属于光合生物所特有的cp SRP43蛋白家族。亚细胞定位结果表明,YGL9位于叶绿体。氨基酸序列比对结果显示,YGL9与拟南芥的cp SRP43的序列高度相似,其成熟蛋白可能也包含了3个CD(CD1-3)结构域和4个Ank(Ank1-4)结构域,这些结构域可能介导了蛋白与蛋白之间的相互作用。

参考文献

[1]The TIC complex uncovered:The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts[J].Masato Nakai.BBA-Bioenergetics.2015(9)

[2]YGL138(t),encoding a putative signal recognition particle 54 kDa protein,is involved in chloroplast development of rice[J].Fantao Zhang,Xiangdong Luo,Biaolin Hu,Yong Wan,Jiankun Xie.Rice.2013(1)

[3]Intracellular Signaling from Plastid to Nucleus[J].Wei Chi,Xuwu Sun,Lixin Zhang.Annual Review of Plant Biology.2013

[4]Signal Recognition Particle:An Essential Protein-Targeting Machine[J].David Akopian,Kuang Shen,Xin Zhang,Shu-ou Shan.Annual Review of Biochemistry.2013

[5]In Vivo Function of Tic22,a Protein Import Component of the Intermembrane Space of Chloroplasts[J].Mareike Rudolf,Anu B.Machettira,Lucia E.Gro?,Katrin L.Weber,Kathrin Bolte,Tihana Bionda,Maik S.Sommer,Uwe G.Maier,Andreas P.M.Weber,Enrico Schleiff,Joanna Tripp.Molecular Plant.2013(3)

[6]The chloroplast protein import system:From algae to trees[J].Lan-Xin Shi,Steven M.Theg.BBA-Molecular Cell Research.2013(2)

[7]Molecular chaperone involvement in chloroplast protein import[J].úrsula Flores-Pérez,Paul Jarvis.BBA-Molecular Cell Research.2013(2)

[8]王忠伟.水稻黄绿叶基因YGL8和YGL9的克隆与功能分析[D].西南大学,2016.