长梗秦艽酮的主要应用

背景及概述^[1]

长梗秦艽，多年生草本，是龙胆科龙胆属植物，主要分布于我国西藏东部和南部地区，作为中草药曾长期用于治疗风湿性关节炎及肝胆疾病。长梗秦艽酮(waltonitone)是从长梗秦艽中分离得到的一个五环三萜化合物。有研究表明，长梗秦艽酮能够抑制肝癌细胞的增殖，同时促进肝癌细胞的凋亡。与此结果类似，长梗秦艽酮能抑制肺癌A549细胞的增殖并可促进其凋亡，提示长梗秦艽酮是一种潜在的抗肿瘤药物。

应用^[1-2]

1. 抗肺癌作用

1）长梗秦艽酮抑制H1975细胞的体外增殖：MTT实验结果显示，随着药物浓度的加大，长梗秦艽酮对H1975细胞增殖的抑制作用明显增加;而且随着作用时间的增加，长梗秦艽酮对H1975细胞增殖的抑制也增强。这些结果提示长梗秦艽酮能够抑制H1975细胞的增殖，且具有剂量和时间依赖性。长梗秦艽酮诱导H1975细胞凋亡在H1975细胞中加入30μmol/L的长梗秦艽酮分别作用24和48h后，通过AnnexinV/PI流式细胞仪双染法测细胞凋亡的变化。结果表明，与对照组相比，长梗秦艽酮处理能显著增加H1975细胞的凋亡，且随着作用时间的增加，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都有所增加，说明长梗秦艽酮能诱导肺癌H1975细胞的凋亡(图2)。

2）长梗秦艽酮引起细胞凋亡的形态学变化：H1975细胞用30μmol/L浓度的长梗秦艽酮溶液作用后，用Hoechst33342染料对细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察显示，与空白对照相比，长梗秦艽酮作用于H1975细胞24、48h后，细胞形态变化明显。随着药物浓度增大，细胞数量减少，细胞核形态变化显著，呈现核碎裂、染色质边集等细胞凋亡改变。

3）长梗秦艽酮调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达：H1975细胞用30μmol/L浓度的长梗秦艽酮溶液作用48h后，提取细胞中的总蛋白进行Westernblot实验。我们筛查了与细胞增殖、凋亡相关的一系列蛋白表达的变化。结果发现，长梗秦艽酮能够抑制Bcl-2蛋白的表达，同时增加Bax蛋白的表达。如图4所示，长梗秦艽酮溶液作用后Bcl-2蛋白的表达显著下降而Bax蛋白表达显著上升，提示长梗秦艽酮对H1975细胞的凋亡诱导可能是通过对Bcl-2与Bax蛋白的调节而实现的。

2. 长梗秦艽酮通过调节Akt和ERK1/2通路抑制人肝癌BEL-7402细胞生长。

1）WT对BEL-7402细胞Akt和ERK1/2磷酸化的影响：BEL-7402细胞经WT单独处理或WT联合ERK1/2抑制剂PD98059或Akt抑制剂wortmannin处理后，用Westernblot蛋白质印迹分析法检测磷酸化ERK1/2和总ERK1/2，磷酸化Akt和总Akt的蛋白表达。结果显示WT(25μmol·L-1)作用1h和2h后，显著激活BEL-7402细胞ERK1/2和Akt磷酸化，阳性对照药物EGF(20μg·L-1)也能明显激活ERK1/2和Akt磷酸化。WT(25μmol·L-1)联合PD98059(50μmol·L-1)处理后，ERK1/2磷酸化激活作用被拮抗，而加入wortmannin(1μmol·L-1)对WT激活ERK1/2磷酸化没有影响。WT(25μmol·L-1)联合wortmannin(1μmol·L-1)处理后，Akt磷酸化激活作用被拮抗，而加入PD98059(50μmol·L-1)对WT激活Akt磷酸化没有影响。

2）WT对BEL-7402细胞活性的影响：不同浓度的WT以及WT联合PD98059或wortmannin处理人肝癌BEL-7402细胞48h，用MTT法检测细胞的活性。结果显示WT能够显著抑制BEL-7402细胞生长，抑制率随着浓度增大而增大。同时，WT(25μmol·L-1)，PD98059(50μmol·L-1)，wortmannin(1μmol·L-1)单独处理对BEL-7402细胞的抑制率分别为77.8%，27.9%，7.6%;WT(25μmol·L-1)与wortmannin (1μmol·L-1)联合处理的抑制率为57.2%，WT(25μmol·L-1) PD98059 (50μmol·L-1)联合处理的抑制率为72.9%。与WT单独处理的抑制率相比，以及与WT和抑制剂单独处理的抑制率单纯叠加相比，联合处理组的抑制率明显降低，说明抑制ERK1/2和Akt通路可拮抗WT对BEL-7402细胞的生长抑制作用。

3）WT对BEL-7402细胞周期的影响　流式细胞分析结果显示，BEL-7402细胞经25μmol·L-1WT处理24h后，细胞周期发生明显的变化。和对照组相比，G0/G1期细胞明显减少，S期细胞明显增多，G2/M期细胞减少，表明WT处理可使BEL-7402细胞阻滞于S期。抑制剂PD98059(50μmol·L-1)和wortmannin(1μmol·L-1)单独处理对BEL-7402细胞周期影响较小。与WT(25μmol·L-1)单独处理组相比，WT(25μmol·L-1)与PD98059(50μmol·L-1)联合处理组，WT(25μmol·L-1)与wortmannin(1μmol·L-1)的联合处理组S期细胞减少，说明抑制ERK1/2和Akt通路可拮抗WT诱导的S期细胞周期阻滞。

主要参考资料

[1] 长梗秦艽酮对吉西他滨耐药肺癌H1975细胞的抑制作用及其机制研究

[2] 长梗秦艽酮通过调节Akt和ERK1/2通路抑制人肝癌BEL-7402细胞生长