REAL TAQ DNA聚合酶的相关研究

背景^[1-4]

REAL TAQ DNA聚合酶是从克隆有Thermu aquaticus DNA Polymerase基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化的。其具有5’-3’DNA聚合酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，无3’-5’外切酶活性。在PCR反应中，Real Taq DNA Polymerase延伸速度为1-2 kb/分钟，产物3’端带A，可直接用TA载体克隆。

Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。一般常用的Taq酶可以分为rTaq酶和LTaq酶两类，LTaq酶的保真性更强，耐热性也比rTaq酶好。TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，来源于极度嗜热的嗜热水生菌Thermus aquaticus YT一1，故称作Taq DNA聚合酶，一般应用于PCR反应。TaqDNA聚合酶是一种Mg2+依赖酶，反应体系中必须有Mg2+存在，然而保持适当的Mg2+浓度十分重要，因为Mg2+浓度过高或过低均会影响引物与模板的结合、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的形成以及酶的活性与精确性。

该酶的优点是：①热稳定性高，92.5℃、95℃、97.5℃时的半衰期分别为130min、40min和5～6min；②最适反应温度为75℃，引物在50℃～60℃退火，72℃延伸，可防止引物与模板间的错配及DNA二级结构的形成，从而提高了扩增特异性，且有利于扩增较长的片段，70℃时延伸速率在60核苷酸/秒以上；③可延迟平台区，平台区到达之前即可完成25次循环，扩增倍数达4 X 106，然而该酶存在一个致命的缺点，即缺乏3’一5’外切酶活性，无法校正错误核苷酸的掺入．错误掺入率达2×10-4个核苷酸/循环，对于一个30次循环的扩增反应来说，这将导致0.25%的总错误率。

相关研究^[5][6]

用于血管外膜淋巴管与内膜增生关系的基础研究

在动脉粥样硬化斑块附近的血管外膜有炎性细胞浸润，而在正常的动脉外膜炎性浸润十分少见，但是一旦动脉粥样硬化发生，那么外膜的炎性浸润则与动脉粥样硬化的严重程度相一致。而且，球囊损伤冠状动脉内膜后外膜出现了炎性细胞浸润。主要表现为巨噬细胞浸润的慢性免疫和炎症反应中的炎症细胞已经被证实能分泌各种细胞因子和生长因子来促进血管新生和淋巴管新生。反之，外膜血管新生又与冠状动脉狭窄和炎症反应程度密切相关。在组织中淋巴管常常与血管相伴行，引流组织中渗出的液体、蛋白质和炎性细胞。近年来研究发现淋巴管在炎症性疾病中表现活跃。淋巴管在慢性皮肤炎症中明显增加；同样，与正常的肾脏比较，有排异反应的移植肾脏中含有大量增生的淋巴管；在慢性气道炎症中，增生的淋巴管防止了粘膜的水肿，并且这些新生的淋巴管能长期存在。

动物模型雄性Wistar大鼠，体重450g-500g。饲养条件为恒温（22℃）、12小时光照12小时黑暗、自主进食普通饲料和水。戊巴比妥钠(30mg．kg-1)腹腔内注射麻醉。颈部正中切口切开皮肤暴露左颈外动脉。2F血栓切除术用球囊导管（Baxter Healthcare Corp.,Irvine,CA,USA）沿颈外动脉切开口送入腹主动脉，生理盐水充盈球囊后向胸主动脉方向回撤球囊三次以充分扩张血管和剥脱内膜。抽瘪并撤出球囊后将颈外动脉切口的近心端结扎，缝合皮肤并让大鼠自主恢复。假手术组不送入球囊扩张，其余步骤相同。成功进行了球囊损伤手术的60只大鼠随机分为6组，每组10只。

另外10只行假手术的大鼠为对照组。球囊损伤组术后1天，3天，7天，14天，28天，90天，对照组于术后1天分别腹腔内注射致死量的苯巴比妥钠处死大鼠，取主动脉标本。部分主动脉组织液氮速冻保存在—80℃低温冰箱日后用于分子生物学试验。其余血管组织用4％磷酸盐缓冲甲醛固定24小时用于免疫组织化学和形态学研究。实时荧光定量RT-PCR按照使用说明用Trizol（Invitrogen，CarlsbAd，CA，USA）抽提主动脉组织中总的RNA。按照反转录酶试剂盒说明书进行反转录酶—聚合酶链式反应（RT-PCR）。1μg RNA加入20μl反转录体系中，应用M-MLV Reverse Transcriptase System（Promega，Madison，USA）寡核甘酸引物法进行反转录。应用LightCycler（Roche Applied Science，USA）实时荧光定量PCR仪对目的基因的表达进行相对定量分析。采用TaqMan荧光探针法进行real—time PCR。

参考文献

[1]Atherosclerosis,autoimmunity,and vascular-associated lymphoid tissue.Wick G,Romen M,Amberger A,Metzler B,Mayr M,Falkensammer G,Xu Q.The FASEB Journal.1997

[2]Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor:a critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy.Dvorak HF.Journal of Clinical Oncology.2002

[3]Arterial wall hypoxia following thrombosis of the vasa vasorum is an initial lesion in atherosclerosis.Martin JF,Booth RFG,Moncada S.European Journal of Clinical Investigation.1991

[4]Angiogenic synergism,vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2.Cao R,Brakenhielm E,Pawliuk R,Wariaro D,Post MJ,Wahlberg E,et al.Nature Medicine.2003

[5]Angiogenic synergism,vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2.Cao R,Brakenhielm E,Pawliuk R,Wariaro D,Post MJ,Wahlberg E,et al.Nature Medicine.2003

[6]徐新生.血管外膜淋巴管与内膜增生关系的基础研究[D].山东大学,2007.