小鼠小肠平滑肌细胞试剂盒的介绍

背景^[1-6]

小鼠小肠平滑肌细胞培养试剂盒适合于培养小鼠的成小肠组织细胞。小肠位于腹中，上端接幽门与胃相通，下端通过阑门与大肠相连。小肠是食物消化吸收的主要场所，盘曲于腹腔内，上连胃幽门，下接盲肠，全长约5－6米，张开有半个篮球大，分为十二指肠、空肠和回肠三部分。其管壁由黏膜，黏膜下层，肌层和浆膜构成。小肠平滑肌肉瘤是起源于小肠壁肌层、黏膜下肌层和肠壁血管平滑肌的恶性肿瘤，是小肠结缔组织恶性肿瘤中最常见的一种。因此，体外小肠平滑肌细胞的培养对研究小肠平滑肌肉瘤提供了基础和前提。平滑肌收缩是胃肠蠕动中基本的运动方式。肠炎时由于平滑肌特殊肌动蛋白的增加导致了平滑肌层的增厚。平滑肌肌动蛋白可能影响收缩力的产生，这进一步证明了炎症时的肠平滑肌细胞具有可塑性。利用肠平滑肌细胞的培养，可以帮助了解收缩、增殖和胃肠道结缔组织对平滑肌细胞的反应。

虽然小肠组织机械韧性很强，但利用试剂盒中提供的小肠组织分离体系来分离，EDTA/EGTA处理过的薄的小肠组织片能使得小肠组织中成小肠细胞的一些功能特性发生改变，从而将成小肠细胞分离开来。本试剂盒包含：

（1）OptiTDSTM小鼠小肠平滑肌细胞组织解离液

（2）小鼠小肠平滑肌细胞组织处理缓冲液

（3）FibrOutTM小鼠小肠平滑肌细胞成纤维抑制剂

（4）小鼠小肠平滑肌细胞组织洗液

（5）小鼠小肠平滑肌细胞生长因子及血清

  (6）小鼠小肠平滑肌细胞基础培养基

（7）小鼠小肠平滑肌细胞组织预备液

应用^[7][8]

用于1型糖尿病小鼠小肠平滑肌钙库操纵钙内流和小肠推进功能增强机制研究

糖尿病肠道病变是1型糖尿病常见并发症之一,常伴随腹泻等症状的发生,可能与肠动力功能紊乱有关,小肠平滑肌组织在维持肠道生理功能的过程中起到非常重要的作用,而Ca2+是介导平滑肌细胞收缩的重要的“第二信使”。钙库操纵的钙内流(Store-operated Ca2+entry,SOCE)是普遍存在的外钙内流机制,参与调节包括平滑肌细胞收缩在内的多种生理功能,Orai1蛋白和基质相互作用分子1(STIM1)是钙库操纵的钙内流的主要组成成分,其中Orai1是位于细胞膜上的通道组成蛋白,STIM1是位于细胞内质网上单次跨膜蛋白,其位于内质网腔内侧的EF手型结构域能够感受到钙库耗竭引起的Ca2+浓度降低,使其与膜上Orai1蛋白形成聚集斑,从而介导SOCE。

方法

1.细胞内钙离子浓度测量用高糖培养基与正常糖培养基培养MUS-M1细胞,分别通过激动剂诱导引起内钙释放,激活SOCE,利用钙成像荧光显微镜系统检测细胞内钙离子浓度变化。

2.蛋白免疫印迹用Western Blot分别检测STIM1与Orai1在正常糖与高糖培养的MUS-M1细胞中表达水平以及糖尿病小鼠小肠平滑肌组织STIM1、Orai1及BKca蛋白表达水平。

3.瞬时转染siRNA将特异性STIM1 siRNA、Orai1 siRNA分别转染MUS-M1细胞,36 h后将细胞进行后续实验。

4.糖尿病模型的制备雄性小鼠,昆明种,5周龄,随机分为注射STZ糖尿病组(DM)和对照组(Control),DM组按40 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)连续注射5天,制备糖尿病模型。正常组腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液。14天后测空腹血糖≥11.1 mmol/L者为DM模型。

5.离体肠管制备以及张力测定离体小肠迅速放进Krebs溶液中等距分为等长肠管(约1 cm),一端固定到浴槽底部,一端连接到张力换能器上,用BL-420数据采集和分析系统分析肠管收缩能力。

6.小肠推进功能用炭末半固体糊灌胃,测量标记物距胃幽门的推进距离占幽门到回肠末端长度比值作为推进功能标准。

7.免疫共沉淀使用Orai1和BKCa抗体分别相互共沉淀,检测糖尿病小鼠小肠平滑肌组织BKc。与Orai1蛋白相互作用强度的变化。

结论

1.高糖刺激导致MUS-M1细胞Orai1和STIM1蛋白的表达升高,从而导致钙库操纵的钙内流增强。

2.糖尿病小鼠小肠平滑肌细胞Orai1和STIM1蛋白表达显著增强,从而使小肠收缩以及推进速度加快。

参考文献

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[4]Gastric Emptying Is More Rapid in Adolescents With Type 1 Diabetes and Impacts on Postprandial Glycemia[J].Shiree J.Perano,Chris K.Rayner,Stamatiki Kritas,Michael Horowitz,Kim Donaghue,Christine Mpundu-Kaambwa,Lynne Giles,Jenny J.Couper.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2015(6)

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[7]Diabetic gastrointestinal motility disorders and the role of enteric nervous system:Current status and future directions[J].S.S.Yarandi,S.Srinivasan.Neurogastroenterol.Motil..2014(5)

[8]郭继政.1型糖尿病小鼠小肠平滑肌钙库操纵钙内流和小肠推进功能增强机制研究[D].安徽医科大学,2016.