（R）-（-）-奎宁环-3-醇的制备方法

背景及概述^[1]

（R）-（-）-奎宁环-3-醇为白色晶体，化学名：(R)-(-)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-醇，分子式为C7H13NO，分子量为127.18，CAS号为25333-42-0，熔点为217-224℃，沸点为120℃，比旋光度为-44.5°(c＝3g/100ml，1NHCl)，在水中的溶解度为1g/ml。（R）-（-）-奎宁环-3-醇是治疗尿频尿失禁药物索利那辛的重要中间体。索利那辛上市剂型为口服片剂，原研公司安斯泰来，2004年6月获欧洲药物管理局(EMA)批准上市，2004年11月获美国食品药品管理局(FDA)批准上市，2006年4月获日本医药品医疗器械综合机构(PMDA)批准上市，2009年9月获国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市。该产品自上市以来成为医药界的一个重磅产品，2013-2015年的年销售额分别为13.3亿、12.2亿、11.3亿。同时（R）-（-）-奎宁环-3-醇还是治疗慢性阻塞性肺病阿地溴铵的关键中间体。阿地溴铵上市剂型为口服吸入性粉剂，原研公司为Almirall和ForestLaboratories，2012年7月获欧洲药物管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)批准上市，2015年3月获日本医药品医疗器械综合机构(PMDA)批准上市。该产品2013-2015年的年销售额分别为1.7亿、2.0亿、1.9亿，未来市场前景不容小觑。因此（R）-（-）-奎宁环-3-醇的制备方法受到科研工作者的广泛关注，目前（R）-（-）-奎宁环-3-醇的制备方法主要有化学合成法和生物合成法。其中化学合成法一般采用手性拆分或借助昂贵的金属催化剂来完成（R）-（-）-奎宁环-3-醇的制备，此两种方法都存在反应收率低、产物光学纯度低、生产成本高的缺点，难以工业化生产。与化学合成法相比，生物合成法具有反应条件温和、转化率高和立体选择性强等优点。

制备^[1-2]

方法1：（R）-（-）-奎宁环-3-醇制备如下：

1）重组酮还原酶的制备

将含有酮还原酶编码基因(SEQIDNo.1、3、5、7或9)的基因工程菌(载体pET24a，宿主细胞E.ColiBL21(DE3))接种至5mL含卡那霉素的LB试管培养基中活化培养(37℃培养12h)，按1％接种量转接活化培养物至400mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养OD至0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.1mM)于25℃诱导培养16h。离心收集菌体，用40mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.5)重悬菌体后，于冰水浴中超声破碎15min，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48h后碾碎，即得重组酮还原酶酶粉。

2）（R）-（-）-奎宁环-3-醇的制备

于25mL反应容器中加入100mM的磷酸盐缓冲液(10mL，pH＝6.5)、葡萄糖(3.6g)及底物3-奎宁环酮盐酸盐(3.0g)，搅拌均匀后加入重组酮还原酶酶粉(120mg)、重组葡萄糖脱氢酶酶粉(15mg)及辅酶NADP(1.5mg)，定容至15mL，30℃下磁力搅拌反应，NaOH(0.5M)控制反应pH在6.5左右，TLC检测反应进程。反应结束后取样离心，上清加NaOH调节pH至13左右，等体积正丁醇萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。GC检测转化率及产物ee值，图谱见图1(底物保留时间为13.1min，S型产物保留时间为18.8min，R型产物保留时间为19.5min)转化率>99％，R型产物ee值>99％。

方法2：（R）-（-）-奎宁环-3-醇制备如下：

1）4-哌啶甲酸乙酯盐酸盐的合成

4-哌啶甲酸(129.0g，1.0mol)，无水乙醇80mL，冰水浴冷却，缓慢滴加SOCl2(225mL，3.0mol)，50min滴毕，升至室温，加热回流3h。减压蒸除溶剂，干燥得白色固体4-哌啶甲酸乙酯盐酸盐，191.7g，收率：99.0％，mp.139.7～140.6℃。

2）N-乙氧羰甲基-4-哌啶甲酸乙酯的合成

4-哌啶甲酸乙酯盐酸盐(40.0g，0.21mol)，乙腈500mL，碳酸钾(71.3g，0.52mol)，室温搅拌10min，滴加氯乙酸乙酯(38g，0.31mol)，滴毕室温搅拌5.5h。过滤，浓缩得46.7g浅黄色液体，收率：93.1％。

3）2-乙氧羰基-3-奎宁酮的合成

叔丁醇钾(67.2g，0.60mol)，甲苯900mL，氮气保护下，加热至回流。缓慢滴加N-乙氧羰甲基-4-哌啶甲酸乙酯(48.6g，0.20mol)的200mL甲苯溶液，约1h加毕，继续回流3.5h。加入250mL盐酸淬灭，室温搅拌1h，静置分层，取水层，有机层用盐酸萃取(3×200mL)，合并水层，用100mL甲苯反洗一次，直接进行下步反应。

4）3-奎宁酮盐酸盐的合成

将2-乙氧羰基-3-奎宁酮的酸溶液加热回流10h，加入活性炭脱色0.5h，过滤，冰水浴冷却下，缓慢加入碳酸氢钠调溶液pH11～12，减压蒸干溶剂，加入3L二氯甲烷打浆，滤除不溶物，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得3-奎宁酮，滴入盐酸乙醇溶液，室温搅拌，析出固体，过滤干燥得白色固体3-奎宁酮盐酸盐25.4g，收率：78.6％，mp.297.1～298.8℃。

5）3-奎宁醇的合成

3-奎宁酮盐酸盐(500g，3.1mol)，20％氢氧化钠水溶液5L，冷却至-5～0℃，搅拌30min，分批加入硼氢化钠(82.0g，2.2mol)，30min内加毕，继续搅拌1h。缓慢滴加6mol/L的盐酸溶液调pH7，室温搅拌10min，缓慢加入固体氢氧化钠调pH11～12，室温搅拌10min。减压浓缩溶液体积约至3L，加入固体碳酸钠至饱和，用氯仿萃取(5×10L)，合并有机相，用5L饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出有机溶剂，得白色固体消旋体3-奎宁醇，丙酮重结晶得372.0g，收率：94.7％，mp.206.2～208.0℃。

6）3-乙酰氧基奎宁的合成

3-奎宁醇(150.0g，1.2mol)，乙酸酐(150mL，1.6mol)，室温搅拌2h。冰水浴冷却下，用饱和碳酸氢钠溶液调pH9～10，继续搅拌10min。用氯仿萃取(3×5L)，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得3-乙酰氧基奎宁，直接进行下步反应。

7）（R）-（-）-奎宁环-3-醇的合成

向上述产物中依次加入450mL乙醇，150mL水，L-(+)-酒石酸(186.0g，1.24mol)加热50℃至溶解，20min后自然冷却至室温，静置析出白色固体，过滤，干燥，得固体。用80％乙醇重结晶得137.0g白色固体R-3-乙酰氧基奎宁醇-L-(+)-酒石酸盐。上述固体在150mL2mol/L的氢氧化钠水溶液中加热至70℃，反应1h，冷却至室温，减压浓缩，加入氯仿(3×200mL)提取，搅拌20min，滤除不溶物，减压蒸除溶剂，干燥得白色固体（R）-（-）-奎宁环-3-醇，43.0g，收率：57.3％，mp.207.2～208.9℃(丙酮-乙醚)，ee值:99.94％。

主要参考资料

[1] CN201610357377.1重组酮还原酶在制备(R)-3-奎宁醇中的应用

[2] CN201711082536.2 一种光学活性3?奎宁醇的制备方法