一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法

本文主要是提供一种实用的肝细胞提取方式，为从事病毒性肝炎、肝硬化和肝癌方面。以及少数从事肝脏的遗传性代谢疾病、免疫性肝病、药物和化学中毒性肝病、肝血管性疾病等研究者提供一些参考。

实验方法 

小鼠肝脏的原位灌洗 用60ml注射器吸取已预温至37℃ 的原代肝 细胞分离液 Ｉ 并连接好静脉输液针与注射器，并将 注射器固定在注射泵插槽内，白炽手术灯距其约20cm加热，进行保温。将预冻冰袋置于不锈钢托盘 上。小鼠经脱臼处死后，立即用注射器针头固定四 肢置于不锈钢托盘的冰袋上，用 75％ 乙醇消毒腹部皮肤，“Ｕ”形切口剪开小鼠腹部、胸，并沿胸廓外沿剪开，完全剪开隔肌，暴露胸、腹器官，并可视心脏 下腔静脉，用平口镊将腹部脏器向右外侧牵拉，暴露并识别肝门静脉。步灌洗，用止血钳结扎小鼠肝前静脉及心脏下腔静脉后，用静脉输液针穿刺肝后静脉，进入约5mm，并同时用小动脉夹固定穿刺入针头前端约3mm位置，剪开肝门静脉，随后开始灌注肝细胞分离液 Ｉ，设定流速为6ml／min，灌注体积为20ml／只，灌流方向从肝后静脉进入，从肝门静脉流出，行逆行灌注；可见肝门静脉缺口有大量血液流出（如图 １Ａ），并逐渐减少，肝脏完全变为土灰色。 第二步灌洗，待步灌洗结束后，随即改用已预温至37℃ 的原代肝细胞分离液 ＩＩ 进行灌洗，设定流速为3ml／min，灌注体积为20ml／只，可见肝门静脉缺口已无血液流出，液体清亮，肝脏逐渐变为土黄色（如图 1B,体积明显膨胀，用平口镊轻触肝脏表面可见不可复原小坑出现。

注：Ａ：步灌洗开始；   Ｂ：第二步灌洗结束。

 小鼠肝脏的酶消化 

用眼科手术剪无菌剥离全肝（去除胆囊部分）,经4℃ ，含 1％ FBS的无菌PBS溶液漂洗后，迅速转至盛有已预热至37℃ 的肝细胞分离液 ＩＩＩ 的 15ml 大玻璃平皿；将小鼠肝脏经眼科剪剪至大小1mm 3后转入37℃水浴锅消化15min；立即向每个肝脏加入5ml DMEM培养基（含10％ FBS）混匀，中止酶消化。 

单细胞悬液的制备 

消化处理后的肝组织悬液经100μｍ 细胞滤器过滤后，再经4℃ 的肝细胞分离用洗涤缓冲液补充体积至30ml，4℃，750ｒ／min，5min离心；吸弃上清，再加入5ml肝细胞分离用洗涤缓冲液，4℃，750ｒ／min，3min离心，洗涤2次，目视上清无明显浑浊出现。

肝细胞的密度梯度离心分离

 沿管壁加入5ml 10％ Opti Prep，用微量移液器吹打至获得的细胞沉渣均匀分布，转移至无菌15ml离心管内；再在上层加入5ml肝细胞分离用洗涤缓冲液，不混匀，标记并立即进行4℃，750ｒ／min，10min离心，吸弃上清后，再加入肝细胞分离用洗涤缓冲液2ml，４℃，750ｒ／min，2 离心洗涤，获得肝细胞。

原代肝细胞的贴壁培养 

向获得的肝细胞沉淀中加入1ml DMEM培养基（含10％ FBS）后，混匀，用细胞计数板计算细胞浓度，按接种密度为2×105个／ml立即接种于预包被有大鼠鼠尾胶蛋白的六孔板或细胞培养皿中。每个培养皿所加培养基以视培养基厚度为1.6～1.8mm为准，于37℃ ，5％ co2细胞培养箱中培养，2h后细胞贴壁，吸弃上清，加入1ml DMEM培养基（含10％ FBS） 小心洗涤未贴壁细胞， 再加入DMEM培养基（含10％ FBS），37℃，5％ CO2细胞培养箱中继续培养（如图 2）。

图 ２ 肝细胞培养 ２４ ｈ 后形态（ × ４０）

TC20 自动细胞计数仪计算 

分离后获得的肝细胞纯度检测采用流式细胞检测技术，对FITC标记细胞角蛋白18（ cytokeratin18）抗体（FITC⁃At18）标记的肝细胞进行分析，即分离后的肝细胞悬液约100μＬ，分别加入2支无菌15ml离心管内，标记为阴性对照 （negative control,NC）管和 FITC⁃At18标记的肝细胞（FITC⁃At18⁃HC） 管，再分别加入1ml 4％ 多聚甲醛，4℃，避光固定15min后，分别加入1ml PBS 溶液，混匀，4℃，750ｒ／min，3min离心，如此洗涤3次；加入3％BSA，４℃，封闭30min后，4℃，750ｒ／min，3min离心，吸弃上清，再加入 500μＬ 按FITC标记抗细胞角蛋白18抗体原液：3％BSA（V／V） ＝ 1∶300稀释后的抗体，４℃，避光过夜孵育；次日，每次以1ml PBS溶液进行洗涤，4℃，750ｒ／min，3min离心，洗涤3次，再加入200μＬPBS溶液，进行流式细胞仪检测。

原代肝细胞的活力分析

分离肝细胞的活力分析（台盼蓝拒染实验）：取0.2ml 4％台盼蓝母液，加入1.8ml PBS溶液中，稀释为0.4％ 作为台盼蓝工作液。取分离后的原代肝细胞悬液约100μＬ 加入1支无菌1.5ml离心管４℃ ，封闭30min后，4℃，750ｒ／min，3min离心，吸弃上清，再加入500μＬ按FITC 标记抗细胞角蛋白18抗体原液：3％BSA（V／ V） ＝1:300稀释后的抗 体，4℃，避光过夜孵育；次日，每次以1ml PBS溶液进行洗涤，4℃，750ｒ／min，3min离心，洗涤3次，再加入200μＬPBS溶液，进行流式细胞仪检测。

原代肝细胞的活力分析 

分离肝细胞的活力分析（台盼蓝拒染实验）：取0.2ml 4％ 台盼蓝母液，加入108ml PBS溶液中， 稀释为0.4％ 作为台盼蓝工作液。 取分离后的原代肝细胞悬液约100μＬ加入1支无菌1.5ml离心管内，加入0.9ml 0.4％ 台盼蓝工作液，3min染色后，利用TC20自动细胞计数仪计数未被染色的细胞数，得活细胞数及活细胞率。

结果

纯度分析通过TC20自动细胞计数仪计算，细胞浓度为5.95× 105 个／ml；从检测结果来看，红色为NC组，蓝色为FITC⁃At18⁃HC组，测得FITC⁃At18⁃HC组阳性细胞百分比为 91.3％，表明初次分离获得原代肝细胞纯度为91.3％ （见图 ３）。

图 ３ 分离肝细胞的纯度测定

从操作流程来看，常规肝细胞提取主要采用胶原酶浸泡的方法消化组织。该方法虽然操作简单（无需灌注），但是浸泡消化的时间和强度不易掌握，得到的肝细胞质量不好（活力一般低于80%），不能满足有些实验的需求。因此本研究选择了操作复杂但效果更好的酶灌注消化法。灌流在肝细胞提取中又是非常重要的环节，直接决定实验所获取细胞的质量。在实际操作中我们发现，小鼠门静脉非常细小，不易穿刺。经过多次摸索，我们在两步灌洗法的基础上，优化出一种更易操作的方法，即采用下腔静脉进、门静脉出的方式。下腔静脉相对门静脉更粗，因此方便穿刺操作。该改良方法相对降低了实验的操作难度，降低了对实验材料的要求（常见的静脉输液针即可满足需求）。同时经改法获得的肝细胞纯度和活力均在90%以上，能够满足大多数的实验需求。在实验中我们也发现，该方法的主要不足之处在于灌流液体可从门静脉流出，因而增大了细胞污染的几率，故要求实验者在操作时应小心谨慎。课题组在传统肝细胞提取方法的基础上，改变了灌流方式，得到了良好的实验结果，为从事相关研究者提供参考。同时，建立和完善肝细胞长期培养技术将为人工生物肝脏研究及其临床应用提供技术参考，具有重要意义。

原创单位：第三军医大学附属医院中心实验室