硒蛋白的制备方法

背景及概述^[1]

至今，硒(selenium)共价结合在蛋白质中仅发现有硒半胱氨酸(selenocysteine，Sec)和硒甲硫氨酸(selenomethionine，Se-Met)两种形式.Se-Met进入蛋白质可能是一随机事件，即由Se-Met随机替代甲硫氨酸而参入到蛋白质分子中；相反，Sec则是由密码子UGA介导的翻译行为。一般把以Sec形式参入到多肽链的蛋白质称硒蛋白(selenoprotein)，而把其他结合硒的蛋白质称含硒蛋白。已发现的硒蛋白大多数是具有重要作用的酶，又称之为硒酶(selenoenzyme)，在硒蛋白特别是硒酶的活性中心发现含有Sec，目前认为硒蛋白是硒在机体内存在的主要功能形式，Sec是生物合成和参入到蛋白质分子中的第21种氨基酸。密码子UGA介导Sec参入蛋白质分子是对经典生物化学的重要补充，但众所周知，UGA同时是三个终止密码子之一，在转译过程中，分子如何识别UGA为Sec密码子而不当作终止密码子，是近年来硒蛋白分子生物学最具吸引力的研究热点.这一过程在原核生物和真核生物之间存在许多差别，并在转译调节上有其独特之处.

种类

从病毒、细菌、真菌、无脊椎动物到脊椎动物都发现有硒蛋白或潜在的硒蛋白基因.如HIV、HBV、痘病毒等病毒的基因结构中具有编码硒蛋白的能力.传染性软疣病毒(MCV)含有与谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)同源的硒蛋白基因，编码一种硒蛋白，对人角质细胞抗UV辐射和超氧离子引起的细胞毒作用有保护作用，同时也为MCV提供保护；出血热病毒也含有一种潜在的硒蛋白基因，经PCR分析，它有17个UGA密码子和数个SECIS(selenocysteineinsertionsequence，SECIS)元件，每分子蛋白质可组装16个Sec，研究者认为该蛋白质与病毒致病性有关。细菌的甲酸脱氢酶、甘氨酸还原酶等[2]为较早期发现的硒蛋白.还有人从真菌中分离出底物特异性硒蛋白B甘氨酸还原酶(PBglycinereductase)，放射性75Se标记发现硒结合在47ku亚基上。小杆线虫(Caenorhabditiselegans)基因编码有与哺乳动物同源的含硒酶硫氧还蛋白还原酶。在哺乳动物至少已发现并分离有35种硒蛋白，其中功能比较明确的硒蛋白是：谷胱甘肽过氧化物酶家族(glutathioneperoxidase，GPx1，GPx2，GPx3，GPx4)、脱碘酶家族(iodothyroninedeiodinases，ID1，ID2，ID3)、硫氧还蛋白还原酶家族(thioredoxinreductases，TR1，TR2，TR3)、硒磷酸化物合成酶(selenophosphatesynthetase，SPS2)、精子线粒体膜硒蛋白(MCS)、34ku精子DNA结合硒蛋白(34kuDNA-boundspermatidselenoprotein)、15ku前列腺上皮硒蛋白(15kuprostateepithelialselenoprotein)和人淋巴细胞硒蛋白(15kuhuman lymphocyticselenoprotein)、硒蛋白P(selenoproteinP)、硒蛋白W(selenoproteinW)和一种存在于多种组织中的18ku硒蛋白(18kuselenoprotein).它们具有防止膜结构及生物大分子的氧化损伤；合成并调节活性甲状腺素T3水平；参与DNA合成并调节DNA表达；促进精子生成、发育、成熟及其活力的维持；保护内皮细胞和维护肌肉组织的正常功能等广泛的生理作用.

制备^[1]

1.  原核生物硒蛋白合成

虽然Sec的合成及其引入到蛋白质肽链中的过程极其复杂，且真核与原核生物间存在较大差异，但目前认为，在原核生物，这一过程是在两种顺式作用元件(cis-actingelement)和四个翻译因子协同作用下完成的。两种顺式作用元件：引导Sec特异性插入位点的Sec-UGA密码子；位于UGA3′端临近下游的介导Sec特异性插入的一种mRNA茎环(stemloop)样二级结构，即SECIS元件.四个翻译因子：两种有关Sec合成的酶，即硒磷酸化物合成酶和硒半胱氨酸合成酶；特异的载体tRNA[Sec]；特异的翻译因子SELB.其对应的基因和功能如表所示：

Sec的生成、运载及硒蛋白的合成过程如下：a.tRNA[Sec]在Ser-tRNA合成酶作用下，生成Ser-tRNA[Sec]；b.在硒磷酸化物合成酶作用下生成硒磷酸化物；c.Ser-tRNA[Sec]以丝氨酸为骨架，在硒半胱氨酸合成酶作用下，以硒磷酸化物为硒供体，形成硒半胱氨酰tRNA(SectRNA[Sec])；d.特异的翻译因子结合并识别SECIS，介导Sec插入肽链.

2. 真核生物硒蛋白合成

在真核生物，关于Sec插入的确切机制至今不明.现有的资料表明，与原核生物相比，至少有以下不同.

1）哺乳动物硒蛋白的Sec-UGA密码子

Sec-UGA体外翻译实验显示，兔网织红细胞裂解液中硒蛋白PGSH-PxmRNA不能翻译相应的Sec-UGA，但GSH-PxmRNA从启始密码子AUG到Sec-UGA相对应的肽链可以在体外合成，这说明该密码子仍起终止密码子作用.硒蛋白三碘原腺甲氨酸脱碘酶(Ⅰ型脱碘酶)，在一过性转染的哺乳动物细胞体内，其Sec-UGA仍可作为终止密码子.因此，在哺乳动物mRNA相同位置的UGA可兼具截然不同的功能。

2）真核生物的SECIS元件

在真核生物，SECIS位于mRNA3′非转译区(3′-untranslatedregions，3′-UTR)。 GPx和硒蛋白PmRNA有一段保守序列形成SECIS或STE，其序列、结构和所在位置都与原核生物不同。事实上，存在于UGA密码子下游至SECIS之间>1kb的序列为真核硒蛋白合成机制增添了诸多奥秘，此间可能有RNA-RNA或(和)RNA-蛋白质因子的识别及相互作用.SBP(seleniumbindingprotein)的发现只是其中之一，它能特异地结合位于硒蛋白GPxmRNA3'UTR的SECIS元件，形成复合体.研究者认为SBP可能就是真核生物的SELB。

3）哺乳动物Sec的转运及其合成途径

其载体为Sec-tRNA，又称Sec-tRNA[Ser]Sec.其二、三级结构与通常的tRNA和细菌tRNA有显著不同，具有独特的氨基酸长臂.在高等脊椎动物细胞中存在Sec的两种同分异构载体tRNA，它们的区别在于反密码子的可摆动苷酸中2′-O核糖的甲基化态不同.该核苷酸的碱基都是5-甲氧基甲基尿嘧啶(mcmU)，而且这些tRNA还有三个不同的修饰碱基，它们的生物合成最近已在Xenopus卵母细胞中构建.此外，tRNA[Ser]SecmcmU和tRNA[Ser]SecmcmUm(或其他2′-O甲基核糖的同源物)均能够在蛋白质合成时阅读UGA密码子，说明这些同分异构受体能够被延伸因子eEF-1识别.为进一步证实tRNA[Ser]Sec的两种酰基化形式(即：Sec-tRNA [Ser]Sec和Ser-tRNA[Ser]Sec)在蛋白质合成中的作用，有人用GPx和硒蛋白Pm RNA研究Sec-UGA的翻译，同时以兔β-球蛋白mRNA终止密码子UGA作为对照，并分析了延伸因子eEF-1对Sec-tRNA[Ser]Sec和Ser-tRNA[Ser]Sec的识别能力。

结果显示，延伸因子eEF-1不识别SectRNA[Ser]Sec，却易于识别Ser-tRNA[Ser]Sec.且在体外系统中，Ser-tRNA[Ser]Sec对GPxmRNA的Sec-UGA和终止密码子UGA均有明显的抑制作用，而Sec-tRNA[Ser]Sec却无此作用。

硒蛋白与疾病的关系^[2-3]

在25种人硒蛋白中，目前生物功能研究较清楚的仅有GPx、Dio和TrxR；生物功能有一定了解、但尚有许多问题需深入研究的硒蛋白有SPS2、SelP、Sep15、SelW、SelM、SelR、SelS、SelT和SelH；生物功能完全未知的硒蛋白有SelI、SelK、SelO和SelV。尽管不同硒蛋白的生物功能各异，但其生化基础主要是硒蛋白中Sec的氧化还原活性，如GPx参与调节胞内氧化还原动态平衡，TrxR调节蛋白质中二硫键与巯基的平衡、参与胞内氧化还原信号传导，Sep15参与内质网上二硫键的形成，Dio通过氧化还原调节甲状腺激素代谢，SelP通过抗氧化在脑神经细胞中发挥作用，SelR是蛋氨酸亚砜还原酶，SelW、SelM、SelH等通过氧化还原作用参与各种重要的生理环节。因此推测：硒蛋白通过氧化还原作用调节生理功能及其与疾病的关系。因篇幅所限，本文仅从硒与癌症、神经退行性病变和病毒三方面对硒与重大疾病的关系进行概述。

1. 硒蛋白与癌症预防

癌症是致人类死亡的三大疾病之一。早年报道补硒200μg天能防止非恶性黑素瘤皮肤癌，降低患前列腺癌、肺癌和结肠癌发生的危险性，使前列腺癌、结肠癌、肝癌的发病率分别降低63%、58%和49%。为进一步确定硒作为癌症化学预防剂的有效性，又启动了其它干预实验。在干预实验中最常用的硒剂量是200μg天，北美人使用的安全上限为400μg天，也有的干预实验使用更高剂量，但整个疗程需监控硒的毒性。评估硒的营养状况和预测硒毒性的生物记物有3种：血浆总硒、SelP和GPx。血浆SelP和GPx作为体内硒蛋白的代表，用作硒营养标记物，它们的浓度在缺硒条件下降低，但随补硒而增加直至由遗传因素和环境因素所确定的硒平台。血总硒则包括了硒蛋白中以Sec形式存在的硒、所有蛋白中的蛋氨酸被硒取代而形成的Se-Met和小分子硒化合物(<总硒量的3%)。由于土壤中硒含量各不相同，世界各地硒摄入量也各不相同。中国某些地区硒摄入量≤10μg天，北美人的硒摄入量为80—140μg天，目前推荐给北美成年人的饮食硒量为55μg天。

人群干预实验显示补硒对癌症的预防作用。在中国林县癌症高发区，补β-胡萝卜素、维生素E和硒5.25年，癌症总死亡率，尤其是胃癌死亡率，显著性降低。给癌症患者每天补充200μg硒，癌症总死亡率显著降低，肺癌、结肠癌和前列腺癌的发病率也显著降低。然而，补硒对预防非黑色素瘤皮肤癌无效。实验结果还表明：在某些实验系统中硒既可抑癌也可促癌。代营养干预预防癌症的研究结果已有综述。美国FDA对硒防癌作用的健康需求值也进行了评估。高剂量硒的摄入具有防治前列腺癌发展的作用。在荷兰进行的6.3年人群实验显示：脚趾甲高硒浓度与低前列腺癌发生的危险性明显相关。对日裔美国人超过20年的跟踪实验也证实血浆中高水平硒与前列腺癌发生的危险性降低呈相关性。另外一个13年跟踪实验表明：高硒水平能显著降低前列腺危险性，尤其是对前列腺发生的特异抗原浓度等于或大于4ngml的人。有关硒预防前列腺癌的综述均指出：补硒能降低前列腺癌发生的危险性]。然而英国和加拿大的大范围病例-对照(case-controlstudy)却认为：尽管高剂量硒能预防前列腺癌，但脚趾甲硒与前列腺癌并不相关。近期也有报道欧洲人的血浆硒浓度与前列腺癌不相关。

血清低硒水平与结肠癌发生具有强相关性。低硒水平结肠癌病人的存活时间和存活率均显著低于较高硒水平的病人。加拿大的病例-对照研究表明：脚趾甲硒水平与结肠癌危险性呈负相关。另外三项临床实验表明：在对年龄、性别、吸烟状况、研究位点进行调整后，测定1736位实验参与者的血硒，发现硒水平高的结肠腺瘤患者，病状复发的危险性低于低硒水平患者。然而，也有一些临床实验未能观察到硒与结肠癌发生危险性的显著相关在血浆硒水平、SelP浓度或GPx活性方面的差异。关于硒与肺癌的关系，许多报道指出：低硒人群，尤其是男性，患肺癌的危险性增高，硒对肺癌的保护作用十分明显。芬兰荷兰两国各自的研究结果均显示硒预防肺癌具有剂量依赖性。血清硒水平与肺癌发生呈负相关，血清硒水平低与谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)缺失之间存在协同作用，使肺癌发生的危险性显著增加。硒在某种程度上能预防肺癌，但只在低硒水平的人群中有效。然而，在一些非欧洲人群中，未观察到血清、指甲中硒与肺癌发生危险性的相关性。当硒被摄入体内，90%以上掺入硒蛋白，仅5%存在于小分子代谢产物中。显然，硒的抗癌活性来源于硒和硒蛋白的共同作用结果。硒蛋白在预防癌症中作用与机理尚不十分清楚。癌症相关硒蛋白报道较多的有GPx、TrxR和Sep15，另外，SelP和SelH与癌症的关系也有少量报道

2. 硒蛋白与脑疾病

哺乳动物脑内含有多种硒蛋白，如GPx1、GPx2、Trx1、Dio2、SelP、SelW、SelR(即MsrB)、Sep15、SelN、SelM等。缺硒动物肝、骨、血中硒水平仅为正常水平的1%，但在脑中硒出乎意料地达到对照组的60%。硒在成年人不同脑区的分布不同：灰质比白质含量高，硒在富含腺体的区域有聚集现象。SelP大量表达于小脑、嗅球、海马区、额叶皮质。除了脑细胞自身能合成硒蛋白外，有些硒蛋白能通过血脑屏障。向缺硒大鼠注射标记75Se的GPx和SelP，75Se-SelP5min内在血浆中消失、大部分被脑摄取。硒蛋白对补硒的响应速度具有不同层次。缺硒时，在降低表达和酶活性方面，GPx4和Dio1比GPx1和GPx3响应迟缓；而在重新补充硒时，这些响应迟缓的硒蛋白却响应更快，从而在硒蛋白中处于较高层次。高层次蛋白比低层次蛋白清楚，但与缺硒相关的脑疾病已有许多报道，如阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD，又称老年性痴呆症)、癫痫、帕金森病、神经分裂症等。在中国农村对2000位年龄≥65岁的老年人进行了指甲低硒水平与认知关系的调查，结果表明：终生处于低硒水平的人群与低认知功能相关。下面仅对硒与AD病的关系和机制做一简介。氧化应激在多种神经退行性疾病包括AD病中起作用，而硒化合物则作为抗氧化剂防止氧化损伤。有报道将原代大鼠海马趾神经细胞用硒代蛋氨酸(Se-Met)预处理16h后，再用Fe2+H2O2或淀粉样β多肽(Aβ25—35)作用于细胞，发现Se-Met能显著提高细胞存活率、降低ROS、提高GPx蛋白表达及活性。说明SeMet能通过对GPx的调控，降低Fe2+H2O2或Aβ诱导产生的自由基。因此有可能成为AD病的潜在治疗剂。

硒可通过掺入硒蛋白来调节自由基的变化，使磷酸酯酶、激酶(MAPK，S6K，PI3K)、蛋白酶(caspase-3)和转录因子的活化处于平衡状态[99]。Aβ肽在神经炎斑的沉积与疾病密切相关。分泌酶介导Aβ肽的产生，γ-分泌酶对AD病的发展具有重要作用，严格控制γ-分泌酶活性是维持Aβ生成动态平衡所必需的。在AD病人脑中易感区域，3个主要的MAPK路径JNK、ERK和p38激酶都被激活。与此一致，ERK通路的上游调节器，包括Ras、Raf和MEK12也在AD病人中被激活。亚硒酸钠通过作用于ERKMAPK而抑制γ-分泌酶活性、减少Aβ产生，发挥神经保护作用。因此，可以用ERK作为药理学靶点筛选能够降低Aβ的硒化合物。控制膳食硒不会直接引起自发式神经功能缺失，但能敏化脑对神经毒素引起的损伤，脑硒和胞内GPx1活性仅略微降低。GPx1敲除小鼠中也未观察到自发式神经功能缺失，但这些小鼠更易受脑局部缺血和神经毒素的攻击，说明GPx1具有抵抗上述作用的能力。SelP缺乏的小鼠，脑硒和GPx、TrxR活性强烈降低，小鼠发展为癫痫和运动失调。在AD病患者脑中MsrA活性较低，β-淀粉体的Met35氧化介导产生自由基，可能危及脑中抗氧化防御系统，导致AD病的发展。补充硒可提高硒蛋白MsrB活性，有可能通过还原被氧化的Met35而阻止或降低Aβ肽的聚集。尽管硒蛋白在预防神经退行性疾病方面有诱人的前景，但目前尚处于初步研究阶段，许多问题尚有待研究解决。

3. 硒与病毒

硒与柯萨奇病毒　宿主细胞内硒的含量会影响许多入侵病毒的复制、突变及毒力。人群调查和病理学研究结果均指出：凡是缺硒的人，多种病毒感染后容易出现明显的症状。我国是克山病(一种具有突发性的心肌疾病)高发地区，20世纪50年代后，首先发现该病与土壤及人群缺硒有关，采用长期对病区人群补硒的方法，目前已基本消灭了克山病。随后发现克山病的病因主要与柯萨奇病毒有关，并用鼠的模型进行了证实。1994年又发现该病毒的无毒株CVB30及有毒CVB320，在缺硒的细胞及大鼠中，无毒株能变为致病的有毒株。缺硒及不缺硒鼠感染了无毒株及有毒株的心肌损伤情况示于图3。缺硒细胞中无毒株发生的突变主要为5′-端非编码区nt234位点的C变为U。另外，在免疫系统受严重损伤的大鼠中，无毒株亦容易变为致病性病毒。用敲除GPx1基因的大鼠做实验，在接种无毒株CVB30后，敲除GPx1基因的大鼠50%出现心肌疾病，而野生型大鼠基本没有出现病变，说明病毒的毒力与细胞的氧化还原状态有关。

主要参考资料

[1] 硒蛋白的分子生物学研究进展

[2] 硒蛋白的分子生物学及与疾病的关系

[3] 硒蛋白、硒与内分泌激素的关系研究进展