花色苷的制备及含量测定

概述^[1]

花色苷（Anthocyanin）是一类广泛存在于植物根、茎、叶、果实等器官的细胞液中的天然色素，是一类由花色素苷配基(苷元)与各种糖通过糖苷键结合而成的黄酮多酚类化合物。花色苷作为一种天然色素，安全、无毒、资源丰富，且对人有许多保健作用，如清除体内自由基、清除DPPH、抗炎、抗癌、延缓衰老、预防糖尿病、保护视力等功能。因此，花色苷现在被广泛应用于医疗、美容、食品等行业。

制备^[1-2]

方法一、一种提取桑葚中花色苷的方法，取新鲜桑葚鲜果，去梗，用搅拌机打 成匀浆，取10g匀浆以低共熔溶剂氯化胆碱-乳酸（摩尔比1：3，含水量0%wt）为提取溶剂，在 固液比1g：30mL，超声功率100W，静电场强度4kV，提取温度50℃条件下提取10min，得花色苷提取液；向上述花色苷提取液中加入5g凹土负载壳聚糖交联环糊精复合物，于30℃、100r/ min条件下摇床震荡4h，离心后取沉淀，用去离子水超声洗涤3次，离心得吸附在凹土负载壳聚糖交联环糊精复合物上的花色苷沉淀；向花色苷沉淀中加质量分数为80%的乙醇进行超声解吸1.0h，离心取含有乙醇的花色苷上清液，将花色苷上清液经0.22um的微孔滤膜过滤 得纯化的含有乙醇的花色苷溶液，在50±10℃下，减压浓缩脱去花色苷溶液中的乙醇，经冷 冻真空干燥去除花色苷溶液中的多余水分，得花色苷产品。花色苷的提取率为9.2427 mg/ g。

方法二、一种从黑果枸杞果实中分离制备花色苷单体的方法，包括以下步骤：

⑴原料预处理：将黑果枸杞果实挑选去杂，用水冲洗，洗去表面浮土，得到处理后的黑果枸杞果实；

⑵配制体积浓度为2%甲酸甲醇溶液：将200 mL甲酸与9800 mL甲醇混合均匀即得；

⑶将所述步骤⑵所得的甲酸甲醇溶液加入到所述黑果枸杞果实中，在室温避光状态下按1 g：1 ~5mL的比例进行常温浸提，提取次数为1~3次，每次12~24 h，合并得到提取液；

⑷所述提取液用滤纸除去不溶物、蛋白质、多糖后，得到滤液，该滤液于旋转蒸发仪上在40~50℃进行真空蒸发浓缩至膏状，得到黑果枸杞花色苷浸膏，并回收甲醇；

⑸大孔吸附树脂的处理：将D-101大孔吸附树脂用体积浓度为95% 的甲醇浸泡 24 小时，然后用体积浓度为95% 的甲醇进行洗涤，再用去离子水清洗；将该大孔吸附树脂缓慢装入树脂柱中，再用去离子水冲洗至柱中颗粒干净，不再沉降为止，即得处理后的大孔吸附树脂；

⑹将所述黑果枸杞花色苷浸膏用体积浓度为2 %的甲酸复溶后上所述处理后的大孔吸附树脂；上样后先以4~6倍柱体积的蒸馏水冲柱，然后再以3~6倍柱体积的甲醇冲柱，将花色苷类化合物解吸附，收集流出液；

⑺所述流出液经减压浓缩后得到花色苷粗品，同时回收甲醇；

⑻将所述花色苷粗品注入高效半制备色谱柱中，在柱温为25~40℃、流速为15~25 mL/min、进样量为200~600 mg、检测波长为525nm的条件下进行半制备色谱分离，根据出峰时间依次收集纯度较低的单体矮牵牛素-3,5-O-diglucosides, 矮牵牛-3-O-rutinoside (trans-p-coumaroyl)-5-O-glucosides；然后采用高效液相色谱系统在柱温为25~40℃、流速为0.6~1.0 mL/min、进样量为10 ul、检测波长为525nm的条件下进行检测，当样品纯度低于90%时，再次采用高效半制备色谱柱进行二次分离，即得纯度≥90%的花色苷单体；最后，所述花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得花色苷单体成品。

含量测定^[3]

梁振等人以黑糯米酒为研究对象，对黑糯米酒花色苷的测定方法进行了研究。结果表明，pH示差法、单一pH法和差减法所测标准曲线的相关系数R2分别为0.997 7、0.998 5、0.999 4，线性关系均较好，均可用于测定黑糯米酒中总花色苷含量。3种方法测定黑糯米酒花色苷的平衡温度为30℃，平衡时间为40 min，测定波长为511 nm。单一pH法和差减法的最适pH值为0.8,pH示差法最适pH值为0.8和4.5。3种方法可直接测定黑糯米酒总花色苷含量，且精密度良好，其中pH示差法精密度最高，相对标准偏差（RSD）为0.83%。pH示差法加标回收率试验结果RSD为0.38%，表明该优化条件后的方法可靠、准确，适用于黑糯米酒中总花色苷测定。

主要参考资料

[1] [中国发明] CN201710451750.4 提取植物花色苷的方法

[2] [中国发明,中国发明授权] CN201310658409.8 一种从黑果枸杞果实中分离制备花色苷单体的方法

[3] 梁振,张元,朱明坚,白卫东,周子烨,苏家杰.黑糯米酒中总花色苷测定方法的研究[J].中国酿造,2019(08):132-136.