新生牛血清的制备方法

背景及概述^[1][3]

新生牛血清是指从出生14小时内未进食的新生牛体上采血，分离血清，并经除菌 过滤后制成的犊牛血清，也有人称之为小牛血清。《中华人民共和国药典》(以下简称《药 典》)三部附录中规定，新生牛血清的各项检测指标应符合以下标准：①总蛋白含量：3.5％- 5.0％；②血红蛋白：不高于0.02％；③大肠杆菌噬菌体：不得有噬菌体污染；④渗透压摩尔 浓度：250-400mOsmol/kg；⑤无菌检查：阴性；⑥支原体检查：阴性；⑦细菌内毒素：不高于 10EU/ml；⑧病毒检查：阴性；⑨支持细胞增殖检查-(Sp2/0-Ag14)：生长曲线(接种浓度)最 大增殖浓度≥1.0×106个/ml，细胞倍增时间≤20h，克隆率≥70％。

新生牛血清具有丰富的营养物质，在细胞培养基中加入适量新生牛血清可 以补充细胞生长所需的生长因子、激素、贴附因子等；新生牛血清还具有解毒作用，能解除脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性；此外，新生牛血清还具有抑制胰蛋白酶 的作用，可以保护细胞免受机械损伤。因此，新生牛血清对细胞的生长有重要促进作 用，是细胞培养基的重要组成部分。

牛血清是细胞培养中用量的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。它提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。它还能够提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力；有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。牛血清还是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。另外牛血清还起酸碱度缓冲液作用以 及提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

制备^[3-4]

一、一种去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法：  

1.新生牛血清采集：

首先对新生牛血清来源的牛群进行健康状况调查，选择无特定病原的黑白花奶牛生下的健康新生公牛(新生公牛不能吃初乳)，通过无菌手术的方法在新生公牛颈静脉采血，将采集到的新生牛血液用大容量冷冻离心机分离血清，将分离得到的牛血清置‑20℃冷冻保存备用。

2.新生牛血清过滤：

将冷冻保存的新生牛血清解冻后进行过滤。

①次过滤新生牛血清，选取膜孔径0.2微米、膜管面积0.5m2的陶瓷复合膜过滤装置，膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度120℃、压力0.1MPa条件下灭菌30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤时，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40 ℃；将收集得到的滤液立即进行第二次过滤。

②第二次过滤新生牛血清，选取膜孔径0.1微米、膜管面积0.5m2的陶瓷复合膜 过滤装置，膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度120℃、压力0.1MPa条件下 灭菌30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤时，调节回流管阀门控制 回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40 ℃；将收集得到的滤液立即进行第三次过滤。

③第三次过滤新生牛血清，选取孔径0.05微米、膜管面积0.5m2的陶瓷复合膜过滤装置，膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度120℃、压力0.1MPa条件下灭菌30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤时，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40 ℃；收集得到的滤液为无免疫球蛋白新生牛血清。

3.膜过滤后的新生牛血清产品检测

感官判断：

取新生牛血清样品透光观察新生牛血清液体有无混有异物及判断液体澄明度，衬 白色背景观察新生牛血清样品颜色，注意有无溶血。

无菌检验：

(1)需氧菌的检测：抽取8份新生牛血清样品，将新生牛血清接种于含5％鲜兔 血酪胨琼脂斜面2支，每支接种新生牛血清0.2毫升，1支置于37℃，1支置于25℃；另用1支葡萄糖蛋白胨水(G.P)，接种0.2毫升，置25℃，均培养5天，观察有无细菌生长。

(2)厌氧菌的检测：抽取8份新生牛血清样品，将新生牛血清接种于厌气肉肝汤1 支，接种新生牛血清0.2毫升，置于37℃培养3天，观察有无菌生长。

支原体检测：

抽取8份新生牛血清样品，将新生牛血清接种于改良Frey氏液体培养瓶2管，每瓶含培养液10毫升，接种新生牛血清0.2毫升，放37℃培养，每天观察有无颜色变化。如在5‑7天内未见变化再从培养瓶取0.5毫升接种于含培养液30毫升的培养瓶中，37℃培养观察，如此重复3次，若无变化则在最后一次接种的培养管经14天观 察，若无颜色变化为无支原体污染血清。

细菌内毒素检测：

抽取3份新生牛血清样品，使用厦门市鲎试剂试验厂生产的内毒素检测试剂盒(终点显色法)检测新生牛血清内毒素含量。

免疫球蛋白含量测定：

抽取3份新生牛血清样品，使用南京建成生物工程研究所提供的血清总蛋白质含量检测试剂盒(双缩脲法)和血清白蛋白含量检测试剂盒(溴甲酚绿法)，分别检测新生牛血清总蛋白质含量和新生牛血清白蛋白含量。血清免疫球蛋白含量＝血清总蛋白质含量‑血清白蛋白含量。

牛病毒性腹泻/黏膜病(BVDV/MDV)抗体检测：

抽取3份新生牛血清样品，使用IDEXX公司提供的HerdChek牛病毒性腹泻抗体检测试剂盒(ELISA法)检测牛病毒性腹泻/黏膜病(BVDV/MDV)抗体。

细胞生长曲线峰值检测：

(1)取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计 数。

(2)将细胞以2×10⁴浓度接种于2个24孔板，分别用含10％新生牛血清血清的 DMEM，37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下进行培养。

(3)24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3孔细胞，分别进 行计数。计算平均值，连续计数8d。

(4)根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐 标绘制生长曲线。

细胞倍增时间检测：

按生长曲线计算细胞的倍增时间。取细胞峰值前一天计得的数(Y)、接种细胞 数(X)及生长时间(T)计算。

倍增时间＝T/A  A＝log2Y/X

细胞克隆率检测：

(1)取对数生长期SP2/0细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，待细胞收缩变圆，用 吸管吹打，制成单个细胞悬液。

(2)对细胞计数，并对其倍数稀释。

(3)进一步稀释，使浓度为10细胞/ml。

(4)将细胞接种于两块96孔板，每孔加入0.1ml，分别用含10％小牛血清和胎 牛血清的DMEM进行培养。

(5)24h后用显微镜观察各孔细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并进行记录。

(6)对标记孔进行观察并持续培养。

(7)培养两周后，记数含单克隆的培养孔数。

克隆率＝含单克隆培养孔数目/培养24h含单个细胞的培养孔数目×100％

4.膜过滤后的新生牛血清检测结果

外观性状：淡黄色澄明液体、无溶血

无菌检验：无需氧菌和厌氧菌生长

支原体检测：无支原体污染

细菌内毒素检测：细菌内毒素＜0.1Eu/ml

免疫球蛋白含量：免疫球蛋白含量＜0.01mg/ml

牛病毒性腹泻/黏膜病(BVDV/MDV)抗体：阴性

细胞浓度：1.86×10⁶

SP2/0细胞倍增时间：3.12h

单克隆效率：50/66×100％＝75.8％

二、新生牛血清的生产工艺，包括以下步骤：

(1)、选取浅黄色、澄清且 粘稠的原料血清，原料血清采集自出生14小时内未进食的新生牛中，上述原料血清pH 值为6.8～8.0，蛋白质含量为3.5％～5.0％，细菌内毒素低于10EU/mL，将原料血清在 低于-15℃的条件下进行入库保存。

(2)、将原料血清移入融化间进行融化，融化间的不锈钢多层架先擦洗干净，再用75％酒精清洁消毒，融化间温度为18～26℃，待融化状态为98％左右，实时巡查剔除破 漏血袋。采用纯净水对原料血清包装袋进行清洗，然后在-5℃～-2℃的条件下保存。

(3)、采用纯化水对原料血清包装袋进行清洗后，再采用注射用水清洗，最后在质 量浓度为75％的酒精中浸泡30分钟消毒。

(4)、将消毒后的原料血清包装袋进行无菌剪口，用100目不锈钢网进行粗滤并存 放于收集瓶中，每瓶取样10ml进行细菌内毒素检查。粗滤后的血清在-2℃～2℃的条件下保存。

(5)、将粗滤后的血清用0.45μm的滤膜进行澄清过滤，澄清后的血清在低于-15℃的条件下速冻，待20％冰冻后，血清在-5℃～-2℃的条件下保存。在澄清过滤前，采用生理盐水进行系统平衡，平衡后的流出物取样进行pH值和细菌内毒素检测，pH值为 6.8～8.0，细菌内毒素低于10EU/mL。

(6)、将速冻后的血清注入灭菌后的混合罐中，在混合罐中进行搅拌，搅拌速度为15～20转/min，搅拌时间为60～70min。混合罐使用前在线湿热高压灭菌、温度121℃、60分钟、压力0.23Mpa，血清入罐前排放罐体及管道蒸汽冷凝水。

(7)、将搅拌后的血清注入筒式过滤器中进行除菌过滤，滤芯孔径为0.1μm，在筒 式过滤器中并联装载有3～7根滤芯，本实施例中装载有5根滤芯，除菌过滤后的血清 通过过渡罐进入自动灌装线进行分装；

(8)、将分装后的血清进行抽样检验，检验项目包括：

蛋白质含量测定：应为3.5％～5.0％(W/V)，方法按《中华人民共和国药典》现行 三版(附录VIB凯式定氮法)进行。

血红蛋白含量测定：应不高于0.02％。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅢD新生牛血清检定要求，氰化高铁法或其他适宜的方法测定)进行。

大肠杆菌噬菌体测定：不得有噬菌体污染。方法按《中华人民共和国药典》现行三 版(附录XⅢD新生牛血清检定要求，噬斑法和增殖法检测)进行。

渗透压摩尔浓度测定：应为250～400mOsmol/kg。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录VH)进行。

无菌检查：应无菌生长。方法按《中华人民共和国药典》现行版三部(附录XⅡA) 项进行。

支原体检查：原体检查阴性。方法按《中华人民共和国药典》现行版三部(XⅡB 直接培养法和DNA荧光染色法)进行。

细菌内毒素测定：应不高于10EU/ml。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅡE凝胶限度试验)进行。

病毒检查：1)细胞培养法：应符合规定。方法按《中华人民共和国药典》现行三 版(附录XⅢD新生牛血清检定要求)进行。

2)免疫荧光抗体检查法：结果应均为阴性。方法按《中华人民共和国药典》现行 三版(附录XⅢD新生牛血清检定要求)进行。

支持细胞增殖检查：

1)细胞生长曲线的测定：细胞的增殖浓度应不低于1ml含106个细胞。

2)细胞倍增时间的测定：细胞的倍增时间不得超过20小时。

3)克隆率的测定：应不低于70％。

以上方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅢD新生牛血清检定要求) 进行。

(9)、对检查合格后的产品进行包装。   

去除内毒素^[2]

CN201410007483.8公开了一种去除新生牛血清内毒素的工艺，步骤如下：取新生牛血清，4000r/min离心10min，取上清，加入上清液质量0.2%的活性炭进行吸附，吸附30min；吸附后，4000r/min离心20min，取上清，依次用0.8μm滤膜、0.65μm滤膜、0.45μm滤膜、0.22μm滤膜、0.1μm滤膜过滤，即得到去除了内毒素的新生牛血清。本发明采用活性炭吸附及逐级过滤的方法，可显著降低以往在新生牛血清生产过程中作为废弃物的高内毒素含量牛血清中内毒素的含量，增加新生牛血清生产的效率和附加值。

主要参考资料

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201510957853.9 一种鉴定新生牛血清质量的方法

[2] CN201410007483.8一种去除新生牛血清内毒素的工艺

[3] [中国发明,中国发明授权] CN201110151000.8 一种去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法

[4] [中国发明,中国发明授权] CN201410341070.3 一种新生牛血清的生产工艺