黄体生成素的制备

概述^[1]

黄体生成素是由垂体分泌的、由α、β两个不同亚基非共价结合成的异二聚体糖蛋白，分子量为29Kda，含有三个糖链。糖链的存在是维持黄体生成素生物效价必需的，其末端唾液酸含量的变化形成了不同的电荷异构体。黄体生成素的α亚基与尿促卵泡素、促甲状腺素、绒促性素具有相同的氨基酸顺序，各自β亚基的不同导致了不同的生物活性。

经研究证明，发达国家约有15～20％的夫妇不能生育，造成不育有多种原因，女性不育的最常见原因是由于促性腺激素缺乏引起排卵功能障碍，男性不育的最常见原因是精子退化或数量太少。人尿黄体生成素对男性和女性的生育功能都极为重要，对男性而言，黄体生成素是精子发生和成熟所必需的，对女性而言，黄体生成素是卵泡成熟、卵细胞分裂、排卵、黄体生成和维持黄体期孕酮分泌必需的促性腺素。

因此，黄体生成素具有治疗价值，可以用于治疗黄体生成素缺乏引起的一系列疾病。而目前黄体生成素是在绝经后尿促性腺素制剂中与尿促卵泡素按固定比例发挥作用，对临床应用造成了很大的限制。

应用^[3]

黄体生成素由腺垂体嗜碱粒细胞分泌，存在于人的血液和尿液中，其作用是刺激卵巢内成熟卵子的释放。尿液中的黄体生成素浓度通常在排卵前36-48小时左右突然大幅度上升，在14-28小时达到高峰，高峰后约14-28小时卵泡膜破裂，排出成熟卵子。女性在黄体生成素高峰后的1-3天内最容易受孕，因而，检测黄体生成素在尿液中的存在水平能够用于预测排卵时间，从而合理避孕或怀孕。。

制备^[2]

一、采集绝经后5～20年的55岁～70岁健康妇女尿液后经过高岭土吸附、乙醇抽提、硅酸滤吸附后制备黄体生成素粗品(LH活性208IU/mg)

二、进行阴离子交换层析方法对粗品进行初步纯化，先经过Q-Sepharose FF(Amersham-Pharmacia公司产品)层析，层析条件选为0.01M Tris缓冲液，pH9.5，0～1M NaCl线性梯度洗脱，收集含黄体生成素组分，超滤脱盐；

三、进行阳离子交换层析方法对粗品进一步纯化，然后使用SP-Sepharose FF(Amersham-Pharmacia公司产品)层析，层析条件选为0.01M NaAc，pH5.2，0～1M NaCl线性梯度洗脱，收集含黄体生成素组分，超滤脱盐；

四、进行疏水层析方法进一步纯化，再使用phenyl-SepharoseFF(Amersham-Pharmacia公司产品)进行纯化，层析条件选为0.01M Tris缓冲液，1M NaCl，pH7.2，用1M～0M NaCl线性梯度洗脱，收集含黄体生成素组分，超滤浓缩；

五、进行分子筛凝胶层析方法将黄体生成素与残存的杂蛋白分开，最后使用Sephadex G-100凝胶过滤，流动相为0.02M NH4Ac，pH7.0。收集含黄体生成素的活性组分，冷冻干燥得到高纯度黄体生成素。

产品采用中国药典2000版附录的黄体生成素生物测定法(幼大鼠精囊增重法)测定黄体生成素效价，效价为9300IU/mg，采用尿促卵泡素生物检定法(幼大鼠卵巢增重法)测定尿促卵泡素效价，小于90IU/mg。黄体生成素与尿促卵泡素之比大于100比1。

黄体生成素重组蛋白饲料：

S1、克隆获得金钱鱼黄体生成素LH基因序列全长，与pGEM-TEasy载体连接后转化至DH5α感受态细胞，扩增培养之后，提取包含目的基因LH和载体pGEM-TEasy的质粒；

S2、选择酶切位点NdeI(238)，XhoI(158)分别对步骤S1提取得到的质粒DNA进行双酶切，回收有效片段，纯化；

S3、将步骤S2回收、纯化得到的目的基因的回收产物导入BL-21表达感受态细胞；摇菌、挑菌，选取有效菌液进行诱导培养，SDS、Western验证蛋白表达，-80℃甘油保存有效菌液；

S4、取步骤S3获得并保存的pET-LH/BL菌液振荡培养，进行重组蛋白诱导表达；挑取单克隆菌落进行扩增培养，收集沉淀，得黄体生成素重组蛋白菌体，即所述黄体生成素重组蛋白饲料添加剂。优选的，步骤S2中，根据pET-28a+载体选择酶切位点NdeI(238)，XhoI(158)。

优选的，步骤S3中，所述摇菌、挑菌，选取有效菌液进行诱导培养具体为：加入LB液体培养基，摇菌；将所摇得的菌液进行离心收集后涂于卡那霉素(Kana+)的LB平板进行挑菌，置于含卡那霉素(Kana+)的LB液体培养基中再次摇菌，选取有效菌液进行诱导培养。

优选的，所述诱导培养具体为：将有效菌液以1∶100转接到LB培养基中，37℃，200rpm，进行大量培养2-3h；当细菌长到OD＝0.4-0.6后，加入IPTG工作液至其终浓度为1mM，37℃诱导培养6-8h，收集菌液。

优选的，步骤S4中，所述震荡培养具体为：每100ul的pET-LH/BL菌液接于1ml含卡那霉素(Kana+)的LB液体培养基中，37℃，振荡培养0.5～1.5h。

优选的，步骤S4中，所述挑取单克隆菌落进行扩增培养具体为：待振荡培养的菌液变浑吸取适量涂于含卡那霉素(Kana+)的LB固体平板培养基上，37℃培养10-14h；挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素(Kana+)LB液体培养基中，置于200rpm，37℃摇床，持续摇菌6-8h，使得大肠杆菌得以大量扩增培养。

主要参考资料

[1] 付灵梅, 谭朝阳, 王丽君, & 曾光辉. (2011). 紫石英对排卵障碍大鼠卵巢局部卵泡刺激素受体、黄体生成素受体表达的影响. 中国实验方剂学杂志, 17(5), 184-186.

[2] 朱桂金, 聂睿, & 徐蓓. (2008). 卵泡刺激素和黄体生成素阈值与阈值窗及卵泡的发育. 生殖医学杂志, 17(6), 401-404.

[3] 朱桂金, & ZHUGui-jin. (2007). 黄体生成素在卵泡发育中的作用和黄体生成素峰. 生殖医学杂志, 16(5), 312-313.