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Methotrexate通过主动转运或易化扩散进入细胞和在细胞内经过多聚谷氨酸化后，会抑制二氢叶酸还原酶和二氢叶酸转化为四氢叶酸。Methotrexate抑制嘌呤和嘧啶的从头合成，多胺的形成以及DNA、RNA、磷脂和蛋白质的转甲基作用。Methotrexate也会抑制胸苷酸合成酶，从而使细胞内胸苷酸不足，这可能导致抗增殖的细胞毒性作用。酶促反应被Methotrexate的多聚谷氨酸化最有效抑制的是5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)转化为甲酰-AICAR，反应被AICAR甲酰基转移酶抑制，因此导致细胞内AICAR的积累和腺苷释放。 Methotrexate增加成纤维细胞、内皮细胞和其他细胞中腺苷的释放。Methotrexate显著增加腺苷的释放，在成纤维细胞中从总嘌呤释放(EC50, 1 nM)的4%到31%，在内皮细胞中，从24%到42%。通过暴露到受激的(fMet-Leu-Phe在0.1 μM下)中性粒细胞，Methotrexate增强的腺苷释放，在成纤维细胞中进一步增加到总嘌呤释放的51% (EC50, 6 nM)，在内皮细胞中增加到58%。 Methotrexate抑制免疫细胞趋药性。Methotrexate (2.5微克/毫升)治疗迅速降低多形核中性粒细胞PMNs的体外趋化反应。 Methotrexate抑制炎症细胞因子的活性。在体外实验中，5 nM Methotrexate抑制IL-1活性，从而抑制血管内皮细胞增殖。 Methotrexate诱导细胞凋亡。来自人类外周血液的T细胞体外活化后，Methotrexate (0.1-10 μM)会诱导其细胞凋亡。

Methotrexate显示出体内抗炎作用。在小鼠气囊炎模型中，Methotrexate以剂量依赖的方式使角叉菜胶处理过的空气袋中聚集的白血球数量减少到60% (IC50 = 0.08 毫克/千克/周)。Methotrexate (0.5 毫克/千克/周)分别增加3倍的淋巴细胞中AICAR浓度，和2倍的炎性渗出物中腺苷浓度。