染料法支原体污染实时定量PCR试剂盒

染料法支原体污染实时定量PCR试剂盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma contamination

货号：Myco-qs-20，规格：20个反应

货号：Myco-qs-20，规格：20个反应

货号：Myco-qs-20，规格：20个反应

储存：-20度，避光保存，有效期一年。避免反复冻融。

试剂盒特点：

1， 对柔膜菌纲（包括支原体、螺原体和无胆甾原体）有极强的特异性，与柔膜菌纲以外的其他基因组无交叉反应。

2， 灵敏度高，最低可检出反应液中2-4个基因组。

3， 使用热启动的Taq酶，可抑制非特异性扩增，降低背景荧光。

4， 带有阳性对照样品（组分C），可用于检验试剂盒有效性，也可用于验证待测样品中是否含有PCR抑制剂。

5， 带有ROX参比染料，帮助校正加样误差和管间差异。

支原体(Mycoplasma)属于柔膜菌（Mollicutes）纲,直径约0.1-0.3 µm,具有变形能力，因此可以轻易穿过常规的0.22 µm无菌滤膜,是常见的动物细胞培养污染源。由于支原体体积太小，在光学显微镜下不可分辨，因此细胞常常在不知不觉中被污染。

目前的经典检测方法是欧洲药典（European Pharmacopeia）2.6.7规定的体外培养法，用特殊培养基对支原体进行培养，以此检测污染情况。培养法的优点是检测灵敏度高，缺点是耗时较长，最长的需要28天之久，而且受操作人员的技能水平影响较大，不同实验室的检测误差较大。随着生物制药业的发展，很多生物制品保质期较短，因此需要一种快速、灵敏并且特异性强的支原体检测方法。欧洲药典因此接纳了核酸检测方法作为培养法的替代方案。定量PCR法可以在几个小时内完成检测，灵敏度与培养法相当，甚至更好。

本试剂盒以16S rRNA基因为靶点，设计了多对引物，可检出大部分已知的支原体，以及部分螺原体和无胆甾原体，与亲缘关系较近的革兰氏阳性菌，如链球菌、梭菌、乳杆菌等，没有交叉反应，在检测范围和特异性方面达到欧洲药典的要求。欧洲药典提及的所有支原体均在本试剂盒的检测范围内。灵敏度方面，最低检测值可以达到每个反应2-4个基因组，在不考虑DNA提取损耗的情况下，达到欧洲药典要求的10 CFU/mL的最低检测值。

本试剂盒包含热启动Taq酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、阳性对照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止残余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用户只需准备好DNA样品即可使用。

注意事项：

1，      本产品仅限于科研使用，不作诊断用途。

2，      操作过程中应注意防范样品之间的串联污染。建议对工作区域进行划分，将不同步骤，如DNA提取和PCR反应液的配制，分开在不同阶段不同区域进行。使用无污染的一次性枪头，建议用带滤芯的枪头。建议在通风区域操作，操作时须佩戴无粉尘手套。

3，      对于在584 nm附近可产生激发光的仪器（大部分使用钨灯或卤素灯作为光源的仪器，还有一些仪器专门配置了LED灯，可激发~584 nm光源），ROX的反应浓度为30-50 nM。对于不能在584 nm附近可产生激发光的仪器（大部分以激光为光源的仪器），ROX的反应浓度为300-500 nM。具体可参考仪器的使用手册。

热启动Taq酶结合了特异性单克隆抗体的DNA聚合酶，在室温下聚合酶活性被抗体抑制。在PCR循环的变性阶段，抗体受热被去除，聚合酶活性恢复，因此获得“热启动”功能，可减少残余DNA的污染，提高PCR扩增效率、灵敏度和目的片段产量。

SYBR Green I可以与DNA双链的小沟结合，结合后在497nm激发光照射下产生520nm的发射光。未结合双链DNA的SYBR Green I基本不产生荧光。因此可以根据荧光值的大小判断溶液内DNA双链的多寡，用于实时检测PCR反应过程中产物的累积量。初始模板浓度越高，反应循环数越高，则双链DNA含量越高，荧光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以结合非特异性PCR产物以及引物二聚体，此时产生的荧光与目标扩增产物无法区分。为了判断荧光信号是否来自目标扩增产物，可以绘制熔解曲线。通过逐步缓慢升温，使双链DNA解离为单链DNA，同时检测荧光值的变化，绘制曲线，根据荧光值观察DNA解链的温度。

UDG和dUTP可以阻止前次步骤残余DNA的扩增。dUTP可以确保扩增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可从单链或双链DNA上去除尿嘧啶残基，从而阻止含有尿嘧啶的DNA作为下几轮PCR的模板。在PCR循环开始前的UDG孵育步骤，可以破坏带有尿嘧啶的PCR产物。经过该去除污染步骤后，UDG在正常的PCR循环过程中被高温灭活，对PCR反应没有影响。

ROX不参与PCR反应，在PCR反应过程中荧光没有变化，可以提供一条基线用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参ROX荧光的比值，使定量更准确。ROX染料的激发波长为584nm，发射波长为612nm。用ROX进行校正后可以使实验误差减小十倍左右。

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