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辣根过氧化物酶(HRP)—迄今为止ELISA中应用最为广泛的标记用酶

发布日期:2018/3/12 14:22:53

HRP是一种分子量达44000的糖蛋白,由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成,中性糖和氨基糖约占18%,主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。每一个HRP分子中含一个氯化血红素IX作辅基,该辅基在403nm波长处有最大吸收峰,而去辅基的酶蛋白在275nm波长处有最大吸收。HRP在403nm的OD值与275nm的OD值之比,也就是所谓的RZ(Reinheits Zahl)值。RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量,并非表示HRP制剂的真正纯度,而且RZ值高的HRP制剂,并不意味着酶活性也高。但可以一纯酶溶液在10mm光径403nm波长下的吸光度来计算酶浓度[1%(W/V)酶溶液吸光度为22.5,浓度为227umol/L]。纯HRP干燥贮存于–20oC可保持稳定,使用1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C(pH 7.4)溶液作为基质冷冻保存,可使酶结合物稳定数年。

HRP对热及有机溶剂的作用比较稳定,用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或l0%甲醛水溶液固定做冷冻切片,均不能使其活性改变。氰化物或硫化物在10–5~10–6mol/L浓度时具有可逆性地抑制HRP的作用;氟化物、叠氮化合物或羟胺仅在高于10-3mol/L浓度时抑制HRP;HRP还可被羟甲基过氧化氢不可逆地抑制。强酸也是HRP的强烈的抑制剂。因此,在酶免疫测定常选用上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。此外,在配制酶免疫测定的稀释缓冲液时,为防止酶失活,应避免使用叠氮钠作防腐剂。

HRP的同工酶主要可分为三种类型:

①含糖量高的酸性同工酶。

②等电点接近于中性(或微碱)的含糖量相对较低的同工酶。

③含糖量低的碱性(PI>11)同工酶。酶免疫试验中所使用的HRP,以PI为8.7~9.0的所谓“C”同工酶为主要组成成分,其他同工酶的活性则很低。“C”同工酶的共价结构由2个密切接近的区域组成,血红素基团则位于其间而成夹心结构,糖链以8个不同的部位结合于多肽。天然的酶所带的纯电荷极少;无游离的。—氨基,仅有2个可测出的组氨酸,6个赖氨酸似乎全被糖链外壳所遮盖。因此,HRP一般仅有1~2个可用于耦联的氨基。

根据HRP的催化特性,ELISA中一般使用过氧化氢(H2O2)作为HRP底物之一,在供氢体(即色原底物)存在时,HRP与H2O2的反应迅速而又专一。由图4可见,HRP被H2O2二价地氧化形成复合物I,而复合物I又可与氢供体的二步连续的单价相互作用而还原至起始状态。复合物Ⅱ是被氧化的带一个电子的中间产物,当H2O2过量,由于复合物Ⅲ或Ⅳ的形成,酶活性受抑制(以后补上)。

30%的H2O2并不稳定。由于H2O2既为HRP的底物,也为其抑制剂,因而ELISA要想得到满意的测定结果,H2O2必须限定在一定的浓度范围内,终浓度通常为2~6 mmol/L。然而在实际研究工作中,一般很少注意这一点。大多数研究者所使用的H2O2的浓度常较理想反应所需的量大2~4倍。吸附于固相的HRP较游离的HRP更易受过量H2O2的抑制。如果30%H2O2贮存液浓度经测定证实确为30%,则稀释10 000—12 000倍常是较为理想的底物。H2O2的摩尔消光系数为10mm光径240nm波长下为43.6,因此,可通过这种方式来检测H2O2工作溶液的浓度。

固相ELISA中,当温度高于20oC时,HRP活性常较低,在底物溶液中加入非离子去垢剂聚山梨醇-20或TritonX-100可延迟HRP的失活,且可使反应温度加大,但非离子去垢剂的这种酶活性保护效应依氢供体的不同而有差异。如以2,2’-联氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉]-6-磺酸(ABTS)为氢供体,则只能保护20%的酶活性,而以邻联茴香胺(ODA)为氢供体时,酶活性的保护提高至90%。

HRP之所以是迄今为止在ELISA中应用最为广泛的标记用酶,主要是因为其一方面易于提取,价格相对低廉;另一方面性质稳定,耐热及有机溶剂的作用,与抗原或抗体偶联后,活性很少受损失。