安丝菌素P-3的制备

发布日期:2019/11/2 13:16:10

【背景及概述】^[1][2][3]

抗生素在为人类控制传染病、肿瘤化疗以及农牧业生产方面做出了卓越的贡献。安丝菌素是Higsahide等人在1977年从诺卡氏菌C-15003的发酵液中分离出的一种新的有潜在抗癌活性的安莎霉素，其母核是19-C的大环内酰胺环，按C-3连接不同长度的碳链，可分为AP-0(美登醇)、AP-1、AP-2、AP-3、AP-3’和AP-4，其中，连接异丁基的安丝菌素 P-3(AP-3)的活性最强，在所有发酵产生的安丝菌素中产量也较高，所以安丝菌素 P-3常作为发酵的目标产物。由于安丝菌素类化合物的生理活性非常强，在哥本哈根举行的第二届世界卫生组织(WHO)专家会议中，安莎类化合物被分为类关键重要性人用抗生素药物。且作为高效低毒的新型靶向药物，安丝菌素在新型抗肿瘤药物抗体偶联物研究中备受关注。安丝菌素(Ansamitocin)便是一种美登素类(Maytansinoid)抗生素，主要是从微生物比如橙色珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum ATCC 31565)发酵生产或高等植物中分离获得，且具有较强的真核细胞毒性及抗肿瘤活性。美登素类化合物抗肿瘤机制与秋水仙碱和长春新碱相似均可阻止细胞的有丝分裂，但其与微管蛋白结合位点上的结合强度约为长春新碱的100倍。安丝菌素本身具有抑制微管蛋白聚集和降解聚集后的微管的功能，因此细胞经过安丝菌素P-3处理后便会停留在有丝分裂中期并出现一系列细胞水平的变化，从而达到抗肿瘤的效果。

【结构】

安丝菌素系列结构如下：

【用途】^[1]

安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3，AP3)是小分子安莎类抗生素，具有抗肿瘤、抗结核杆菌、抗细菌等多种药理活性；其组分有P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4和 P-4'，其中安丝菌素P-3为主要合成产物，其通过阻碍微管形成从而阻止细胞的有丝分裂使细胞死亡，在体外及荷瘤动物中具有显著抗肿瘤作用。

【制备】^[2][3]

方法1：一种安丝菌素P-3的提取与分离纯化方法，该方法包括以下步骤：

1) 将发酵结束的发酵液或固体发酵培养基用萃取溶剂进行萃取，得到萃取液；

2) 将步骤1)得到的萃取液集中浓缩至无萃取溶剂流出得到浓缩浸膏粗品A，然后加入中性氧化铝，并用有机溶剂使其与粗品A混合均匀；

3) 将步骤2)混合均匀的粗品A旋蒸至干燥的沙状；

4) 将有机溶剂加入到步骤3)干燥的沙状粗品A中，震荡静置，取上清液；

5) 将步骤4)的上清液集中浓缩，加入硅胶旋蒸至沙状，用柱层析法梯度洗脱得到安丝菌素P-3。

方法2：一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，步骤如下：

1) 孢子培养：将在20％甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿划线培养，25～30℃培养3～9天，至生长出丰富孢子；所述的束丝放线菌为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)；所述的固体培养基的组分为酵母提取物0.1～5％，大豆蛋白胨0.3～1.0％、麦芽浸膏0.1～0.5％，甘油0.5～1.5％，琼脂粉1.5～2.2％，均为重量百分比，自然pH；

2) 种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25～30℃进行培养30～50h，获得种子液；所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1～5％，酵母粉0.5～2％，大豆蛋白胨0.5～2％，pH为7.0～8.0，均为重量百分比，pH为7.0～8.0；

3) 发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25～30℃发酵培养，溶氧控制20％以上，发酵持续时间350～450h；所述的液体发酵培养基的组分为玉米淀粉4～7％，玉米浆干粉1.5～2.5％，热榨豆饼粉1～3％，葡萄糖0.1～1％，K₂HPO₄·3H₂O 0.02～0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.1～1％，CaCO₃0.3～0.7％，CaCl₂0.05～0.2％，异丁醇0.2～0.5％，CoCl₂·6H₂O 0.0002～0.001％，FeSO₄·7H₂O0.0001～0.0003％，均为重量百分比，pH为6.8～7.5；步骤3)中当种子液接种液体发酵培养基后开始补加浓度为20～25％的葡萄糖溶液，流速0.4～0.5mL/L/h，发酵至48～72h后补加含有20～30％的葡萄糖和5～15％热榨豆饼粉的补料液，流速0.8～1.2mL/L/h，同时，每24h每升发酵液一次性添加1.8～2.0mL的异丁醇，直至发酵结束。